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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-72136
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7213/


Wnt- und Notch-Signale im Knochenstoffwechsel

Wnt And Notch Signaling In Bone Metabolism

Yorgan, Timur Alexander

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SWD-Schlagwörter: Knochen , Stoffwechsel , Osteoblast , Osteoklast , Osteozyt , Maus , Signal
Freie Schlagwörter (Deutsch): Wnt , Lrp5 , Sclerostin , Notch , Hajdu-Cheney-Syndrom
Freie Schlagwörter (Englisch): Wnt , Lrp5 , Sclerostin , Notch , Hajdu-Cheney syndrome
Basisklassifikation: 44.77
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schinke, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.02.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 16.03.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Die Osteoporose ist eine der weltweit am weitesten verbreiteten Krankheiten mit erheblichen sozialökonomischen Auswirkungen. Die in den meisten Fällen zum Einsatz kommende Therapie ist die Behandlung mit anti-resorptiv wirkenden Bisphosphonaten, die den Knochenverlust aufhalten können aber langfristig eine Verschlechterung der Knochenqualität zur Folge haben, die wiederum zu Frakturen führen kann. Um kosteneffektive, osteoanabole Behandlungsoptionen zu generieren, die den aktiven Aufbau der Knochenmasse stimulieren, ist es erforderlich die molekularen Interaktionen aufzuklären, die die Knochenformation kontrollieren. In diesem Zusammenhang sind Osteozyten als zentrale Regulatoren des Knochenstoffwechsels von entscheidender Bedeutung. Sie sind unter anderem die Hauptquelle des sekretierten Proteins Sclerostin, das die Knochenformation äußerst potent unterdrücken kann. Dennoch ist bisher nicht bekannt, welche Mechanismen an der Differenzierung dieses Zelltyps beteiligt sind. Die Assoziation von Mutationen im NOTCH2-Gen mit dem Hajdu-Cheney Syndrom, einer Erkrankung die sich unter anderem durch einen Knochenmasse-Verlust auszeichnet, führte zur Hypothese, dass Notch-Signale möglicherweise über den Mechanismus der lateralen Inhibition an der Differenzierung von Osteozyten beteiligt sind.
Vorhergegangene Studien haben nahegelegt, dass Sclerostin ein Antagonist des Wnt-Co-Rezeptors Lrp5 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) ist, was die Entwicklung eines anti-Sclerostin Antikörpers als osteoanabole Therapieoption zur Folge hatte. Dennoch gab es keinen klaren in vivo Beweis für diese Interaktion und alternative Wirkmechanismen wurden erörtert. Daher wurden in dieser Arbeit zunächst Mäuse charakterisiert, die Sclerostin transgen in Osteoblasten überexprimierten und die als Phänotyp, den Erwartungen entsprechend, eine deutlich verringerte Knochenmasse, bedingt durch eine reduzierte Knochenformationsrate, aufwiesen. Diese Tiere wurden anschließend mit zwei Mauslinien verpaart, die hohe Knochenmasse-hervorrufende Mutationen (HBM) im Lrp5-Gen trugen, die angeblich die Sclerostin-Bindungsstelle zerstören. Parallel hierzu wurden Mäusen, die genetische veränderte Varianten von weiteren potentiellen Komponenten des Wnt-Rezeptorkomplexes trugen (Kremen2 und Frizzled9) mit den Lrp5-HBM Linien verpaart. In vivo Analysen von weiblichen und männlichen Tieren im Alter von 12 Wochen mittels µCT und Knochenhistologie, sowie in vitro Versuche mit primären Osteoblasten zeigten, dass die Lrp5-HBM-Mutationen die Wirkung von Kremen2 und Frizzled9 nur geringfügig beeinflussten. Der Effekt der Sclerostin-Überexpression hingegen wurde durch die Lrp5-HBM-Mutationen in den HBM-Phänotyp umgewandelt. Somit konnte in dieser Arbeit erstmalig ein schlüssiger in vivo Beleg für die Interaktion von Sclerostin mit der postulierten Bindungsstelle von Lrp5 erbracht werden. Dies ist von bedeutender klinischer Relevanz, da somit eine vereinheitlichende Hypothese der Funktion der beiden Moleküle, die in Personen mit Osteosklerose mutiert sind, untermauert werden kann.
Um die Bedeutung von Notch2 für den Knochenstoffwechsel und die Osteozyten-Differenzierung näher zu erörtern, wurde in dieser Arbeit der skelettale Phänotyp von Mäusen mit Osteoklasten- und Osteoblasten-spezifischer Notch2-Defizienz untersucht und ein Mausmodell des Hajdu-Cheney Syndroms generiert. Radiologische und histologische Untersuchungen zeigten, dass die Osteoklasten-spezifische Defizienz keine messbaren Effekte hervorrief, wohingegen die Osteoblasten-spezifische Defizienz eine Erhöhung und Umverteilung der trabekulären Knochenmasse in Röhrenknochen zur Folge hatte, die wahrscheinlich auf die größere Osteoblastenanzahl zurückzuführen war. Die Analyse des erfolgreich generierten Mausmodells mit einer Hajdu-Cheney-Mutation im Notch2-Gen ergab, dass diese Tiere zwar keine Acro-Osteolysen aufwiesen, aber eine Reduktion der Knochenmasse, die mit einem erhöhten Knochenumsatz einherging. Es konnten jedoch keine Hinweise gefunden werden, die die Hypothese einer Notch2-Beteiligung an der Osteozyten-Differenzierung unterstützen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig ein Mausmodell des Hajdu-Cheney Syndroms generiert, und in vivo der Einfluss von Notch2 auf den Knochenstoffwechsel nachgewiesen. Dass ein erhöhter Knochenumsatz und die Osteoblasten-Differenzierung als primär beteiligte Mechanismen identifiziert wurden, ist von hoher klinischer Bedeutung, da dies einerseits zum Verständnis des Hajdu-Cheney Syndroms beiträgt und andererseits zeigt, dass die Modulation der Notch-Signale ein sinnvoller Ansatzpunkt für eine osteoanabole Therapie ist.
Kurzfassung auf Englisch: Osteoporosis is one of the most prevalent disorders worldwide with a substantial socioeconomic impact. In most cases anti-resorptive drugs from the class of bisphosphonates are used for treatment. These are able to arrest the bone loss but may lead to a decrease in bone quality and increased fracture risk in the long term. In order to create cost-effective osteoanabolic treatment options the molecular interactions controlling bone formation need to be elucidated. Osteocytes, the central regulators of bone metabolism, are of paramount importance in this context. They are the main source for Sclerostin, a secreted protein with the ability to effectively suppress bone formation. However, it is still unknown what mechanisms are involved in the differentiation of this cell type. The association of mutations of the NOTCH2 gene with the Hajdu-Cheney syndrome, a disorder characterized by loss of bone mass, has led to the hypothesis, that Notch-signaling is possibly involved in the differentiation of osteocytes by way of the lateral inhibition mechanism.
Previous studies have suggested that Sclerostin functions as an antagonist for the Wnt co-receptor Lrp5 (Low-density lipoprotein receptor-related protein 5) and this has led to the development of an anti-Sclerostin antibody as an osteoanabolic treatment option. Yet clear in vivo evidence for this mechanism was still missing, and alternative mechanisms have been discussed. Therefore, mice over-expressing Sclerostin specifically in osteoblasts were initially characterized in this thesis. As expected, they displayed a severely reduced bone mass caused by a decreased bone formation rate. Subsequently these mice were crossed with two mouse lines with high bone mass causing mutations (HBM) in the Lrp5 gene. These mutations supposedly act by inactivating the Sclerostin binding site. In parallel, mice carrying genetically modified versions of further potential components of the Wnt receptor complex (Kremen2 and Frizzled9) were crossed with the two Lrp5-HBM lines. In vivo analysis of 12 week old male and female mice via µCT and bone histology as well as in vitro experiments involving primary osteoblasts demonstrated that Lrp5-HBM mutations only marginally influenced the effects of Kremen2 and Frizzled9. In contrast, the effect of Sclerostin-overexpression was abolished by the Lrp5-HBM mutations, thus transforming it into a HBM-phenotype. Accordingly this work presents the first compelling in vivo evidence for an interaction of Sclerostin with its postulated binding site on Lrp5. These results are of considerable clinical relevance since they provide substantial support for a unifying hypothesis involving the function of the two molecules mutated in individuals with osteosclerosis.
To elucidate the role of Notch2 in bone metabolism and osteocyte differentiation, the skeletal phenotype of mice with a cell type specific deficiency of Notch2 in osteoclasts or osteoblasts was investigated and a mouse model for the Hajdu-Cheney syndrome was generated. Radiological and histological studies showed no measurable effects in the osteoclast specific deficiency whereas the osteoblast specific deficiency resulted in an increased and relocated trabecular bone mass in long bones. This phenotype was probably caused by an increased number of osteoblasts. No acro-osteolysis was detectable during the analysis of the successfully generated mouse model carrying one of the mutations associated with the Hajdu-Cheney syndrome in the Notch2 gene. Nonetheless a reduction of bone mass was observed along with a high-turnover situation. However no evidence was observed that supports the hypothesis of an involvement of Notch2 in the differentiation of osteocytes. This thesis represents the first time that a mouse model of the Hajdu-Cheney syndrome was generated and the influence of Notch2 on bone metabolism was investigated in vivo. It is of significant clinical relevance that Notch2 primarily affects bone turnover and the differentiation of osteoblasts, since this provides further insight into the Hajdu-Cheney syndrome. In addition these results clearly show that the modulation of Notch signaling is a reasonable target for the development of osteoanabolic therapies.

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