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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-72169
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7216/


Skelettale Charakterisierung lysosomaler Speichererkrankungen in murinen Modellen

Skeletal characterization of lysosomal storage disorders in murine models

Kühn, Sonja Christin

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SWD-Schlagwörter: Knochen , Mucopolysaccharidose , Speicherkrankheit , Maus , Therapie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Lysosomale Speichererkrankung
Freie Schlagwörter (Englisch): Lysosomal storage disorder
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schinke, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.01.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 17.03.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Kürzlich konnten wir in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Braulke (Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin, UKE, Hamburg) den Knochenphänotyp des Mausmodells für Mucolipidose Typ II (MLII-Maus) analysieren, einer lysosomalen Speichererkrankung (LSD) mit einer generalisierten lysosomalen Dysfunktion. Es zeigte sich, dass das Längenwachstum aufgrund einer Akkumulation lysosomalen Speichermaterials in Chondrozyten der Wachstumsfuge in den MLII-Mäusen beeinträchtigt war, und dass der osteoporotische Phänotyp dieser Mäuse von reduzierter Knochenbildung durch Osteoblasten begleitet wurde. Unerwartet war jedoch, dass die Osteoklasten der MLII-Mäuse keine pathologischen Veränderungen aufwiesen, aber in ihrer Anzahl deutlich erhöht waren. Diese Beobachtungen konnten auch in einer Knochenbiopsie eines MLII-Patienten bestätigt werden. Wir konnten ebenfalls zeigen, dass IL6, ein Zytokin, das die Osteoklastogenese positiv beeinflusst, in Osteoblasten und Chondrozyten von MLII-Mäusen verstärkt exprimiert wird. Durch eine Behandlung mit Bisphosphonaten konnte der osteoporotische Phänotyp der MLII-Mäuse verhindert werden. Da die oben beschriebenen Ergebnisse aufzeigen, dass eine lysosomale Fehlfunktion zu sehr spezifischen Veränderungen von Differenzierung und Aktivität Knochen-relevanter Zelltypen führt, ist es von entscheidender Bedeutung, die gleiche Art der Analyse auch zur Erforschung anderer lysosomaler Speicherkrankheiten anzuwenden.
Mucopolysaccharidose Typ I (MPSI) gehört zu den lysosomalen Speichererkrankungen, ausgelöst durch inaktivierende Mutationen in der α-L-Iduronidase (IDUA), die für die lysosomale Degradation der Glykosaminoglykane (GAG) wie Heparan- und Dermatansulfat essentiell ist. Diese IDUA-Inaktivierung führt auf zellulärer Ebene zu einer pathologischen Anreicherung von GAGs, die eine negative Beeinträchtigung von Organfunktionen in MPSI-Patienten zur Folge haben. Die Patienten zeigen Pathologien wie skelettale Dysplasie, Leber- und Nierenvergrößerung, sowie Beeinträchtigungen der Hirnfunktionen und des Sehvermögens. Eine komplette Heilung der Krankheit ist bislang nicht möglich. Bei schwer betroffenen Patienten wird häufig eine Knochenmarktransplantation (KMT) durchgeführt, wodurch die defekten Glia-Zellen im Gehirn teilweise ersetzt werden können, aber auch eine Enzymersatztherapie (EET) wird als Option genutzt.
In dieser Dissertation sollte zunächst der skelettale Phänotyp Idua-defizienter Mäuse auf histologischer, zellulärer und molekularer Ebene charakterisiert werden. In einem weiteren Schritt sollte der Einfluss einer KMT und EET auf den skelettalen Phänotyp Idua-defizienter Mäuse untersucht werden.
Der in den Idua-defizienten Mäusen gezeigte Knochenremodelling-Phänotyp ist sehr komplex und nicht in vitro zu simulieren, was wahrscheinlich durch die Akkumulation von Glykosaminoglykanen in und auf der Knochenmatrix erklärt werden kann. Die Idua-/--Mäuse zeigten keine Skelett- oder Entwicklungsabnormitäten oder Beeinträchtigungen im Längenwachstum. Sie wiesen jedoch eine cranio-faziale Zunahme des Gewebevolumens und der Porosität im Kiefer auf, sowie eine trabekulär stark erhöhte Knochendichte mit signifikant reduzierter Anzahl an Osteoklasten und Osteoblasten und einer Umverteilung der Osteoblasten-Reihen auf. Zudem konnte ein massiver Defekt der Osteozyten durch Einlagerung von großen Ansammlungen an Speichermaterial gezeigt werden. Durch eine kombinierte Therapie aus KMT und EET konnte der skelettale Knochenphänotyp der Idua-defizienten Mäuse normalisiert werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass sich der Knochenphänotyp des hier analysierten Idua-defizienten Mausmodells grundsätzlich von dem der MLII-Mäuse unterscheidet, und dass eine detaillierte Charakterisierung einer jeden lysosomalen Speichererkrankung dringend notwendig ist, um gezielte Therapieoptionen anwenden zu können. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine KMT mit sich anschließender EET die Methode der Wahl ist, um den pathologischen Knochenphänotyp der Idua-defizienten Mäuse zu korrigieren.
Das zweite in dieser Arbeit analysierte Mausmodell zeigt eine lysosomale Speichererkrankung mit kombinierter Defizienz der LAP (Lysosomal acid phosphatase, Acp2) und der TRAP (Tartrate-restistant acid phosphatase type 5, Acp5). LAP ist ein biochemischer Marker für Lysosomen, TRAP ist ein klassischer Osteoklastenmarker. In Kombination dephosphorylieren Acp2 und Acp5 Mannose-6-Phosphat-haltige lysosomale Proteine. Im Mausmodell äußerte sich eine Defizienz dieser beiden Gene in einer erhöhten trabekulären Knochenmasse und einem verminderten Längenwachstum mit verbreiterter Wachstumsfuge. Die Osteoklasten zeigten eine eingeschränkte Resorptionsfunktionalität mit einer erhöhten Expression von Cathepsin K, einer lysosomalen Hydrolase, die über den M6P-abhängigen Weg aus dem Osteoklasten in die Resorptionslakune transportiert wird. In vitro war die intra- und extrazelluläre Aktivität dieser Hydrolase reduziert, was durch einen möglichen intrazellulären pH-Abfall aufgrund der Enzymdefizienz erklärt werden könnte. In vivo konnte hingegen eine intrazellulär erhöhte Lokalisation von Cathepsin K in den doppeldefizienten Tieren nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Gene im Transport der lysosomalen Hydrolase eine Rolle spielen.
Eine weitere Auffälligkeit dieses Acp2/Acp5-defizienten Mausmodells war ein veränderter Fettphänotyp der Tiere. In einem Experiment mit Kälteeinfluss zeigten die doppel-defizienten Mäuse bei einem geringeren Körpergewicht mit kleineren Fettdepots einen höheren Energieverbrauch und ein stärkeres Browning im weißen Fettgewebe, gekennzeichnet durch eine erhöhte Expression zweier Markergene, dem Ucp1 und Fgf21. In vitro Untersuchungen von Adipozyten aus Acp2/Acp5-defizienten Mäusen ließen auf eine beeinträchtigte Adipogenese mit einem zellautonomen Defekt der Adipozyten schließen.
Kurzfassung auf Englisch: In cooperation with the group of Prof. Dr. Thomas Braulke (Department of Biochemistry, Children´s Hospital, University Medical Center Hamburg Eppendorf ) we were recently able to analyze the skeletal phenotype of a mouse model for mucolipidosis type II, a lysosomal storage disorder (LSD) characterized by a generalized lysosomal dysfunction. While the function of growth plate chondrocytes and bone-forming osteoblasts was impaired due to lysosomal accumulation of non-degraded material, bone-resorbing osteoclasts appeared morphologically intact and were not functionally affected. Osteoclastogenesis was markedly increased in MLII mice, and a similar observation was made in one individual with MLII. Using a combination of cell culture experiments and in vivo analyses we could further show that IL6, a cytokine known to increase osteoclastogenesis, was highly expressed in MLII osteoblasts and chondrocytes. The osteoporotic phenotype of MLII mice could be prevented by bisphosphonate treatment. Since these findings demonstrated the importance of a deep phenotyping approach for fully understanding the disease pathologies, our aim was to perform the same type of skeletal analysis for another lysosomal storage disorder.
Mucopolysaccharidosis type I (MPSI) is caused by homozygous inactivating mutations of the IDUA gene, encoding the lysosomal enzyme α-L-Iduronidase, an enzyme primarily required for degradation of heparan and dermatan sulfate, representing two highly abundant glycosaminoglycans (GAGs). IDUA-inactivation leads to a pathological accumulation of GAGs within cells resulting in impairments on organ function in patients with MPSI. Patients are characterized by mental retardation, hepatosplenomegaly, dysostosis multiplex, corneal clouding, and cardiac dysfunction. A complete cure of the disease is not yet possible, most of the affected individuals are currently treated by bone marrow transplantation (BMT) in early childhood, which reduces some of the detrimental symptoms, possibly due to substitution of glial cells, or by enzyme replacement therapy (ERT).
The first goal of this thesis was to characterize the skeletal phenotype of Idua-deficient mice on a histological, cellular and molecular level. In a further step, the influence of BMT and ERT on skeletal remodeling of Idua-deficient mice should be studied. The bone remodeling phenotype shown in the Idua-deficient mice was very complex and no in vitro simulation was probably explained by accumulation of glycosaminoglycans within the bone matrix. Idua-deficient mice showed no major abnormalities of skeletal patterning, development or growth, but a cranio-facial increase in tissue volume and porosity in the jaw bone and a dramatically elevated trabecular bone density with significantly reduced numbers of osteoclasts and osteoblasts and a redistribution of osteoblasts. In addition, a massive defect of osteocytes by incorporation of large accumulations of storage material was shown. Through a combined therapy with BMT and ERT, the skeletal bone phenotype of the Idua-deficient mice could be rescued. In summary, these results show that the bone phenotype of the Idua-deficient mice differs from the one of MLII mice and that a detailed characterization of each lysosomal storage disease is an urgent need to apply targeted treatment options. Furthermore, it was shown that BMT in combination with ERT is the method of choice to correct the pathological bone phenotype of Idua-deficient mice.
The second analyzed mouse model displays a lysosomal storage disease with combined deficiency of LAP (Acp2) and TRAP (Acp5). LAP is a biochemical marker for lysosomes, TRAP is a classical marker for osteoclasts. In combination Acp2 and Acp5 dephosphorylate mannose-6-phosphate (M6P)-containing lysosomal proteins. In the mouse model a deficiency of these two genes caused an increased trabecular bone mass and reduced bone growth associated with a widening of the growth plate. The osteoclast function was found to be impaired with increased expression of cathepsin K, a lysosomal hydrolase that is transported via the M6P-dependent pathway into the resorption lacuna. In vitro it was shown that intracellular and extracellular activity of this lysosomal hydrolase was reduced possibly explained by a intracellular pH drop due to the enzyme deficiency. In contrast, Cathepsin K showed in vivo an increased intracellular localization. These results indicate that both genes play a role in trafficking of cathepsin K.
Another interesting point in the Acp2/Acp5-deficient model was the altered fat phenotype. In a cold induction experiment it was shown that in comparison to wildtype Acp2/Acp5-deficient mice had an increased food intake, reduced fat pads and a higher energy expenditure with a browning of white adipose tissue that is characterized by an increased expression of the genes, Ucp1 and Fgf21. In vitro studies of adipocytes from Acp2/Acp5-deficient mice pointed to impaired adipogenesis with a cell autonomous defect of these cells.

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