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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-72398
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7239/


Die postsynaptische Lokalisierung des Proteins IRSp53 in Abhängigkeit seiner funktionellen Domänen

The association of IRSp53 to the postsynaptic density depends on the function of the protein's domains

Becker, Cord-Christian

pdf-Format:
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Basisklassifikation: 44.48
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kreienkamp, Hans-Jürgen (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.03.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 24.03.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Lernen ist einer der wichtigsten Vorgänge menschlichen Lebens. Erkrankungen wie die Alzheimer-Demenz zeigen deutlich, dass eigenständiges Leben ohne Gedächtnis nicht möglich ist. Ein molekulares und zellbiologisches Korrelat dafür ist die synaptische Plastizität, die zum größten Teil auf Vorgängen in der postsynaptischen Dichte (PSD) basiert. Sie ist der spezialisierte Teil der postsynaptischen Region einer exzitatorischen Synapse und enthält Neurotransmitter-Rezeptoren, die für die postsynaptische Signal-transduktion benötigten Proteine und Gerüstproteine. Ein wichtiger Bestandteil der PSD ist das Insulin-Rezeptor Substrat von 53kDa (IRSp53). Genetische Studien haben eine Verbindung von IRSp53 zu diversen neurologischen Erkrankungen wie Autismus oder ADHS gefunden. IRSp53 spielt eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen GTPasen und dem Aktin-Zytoskelett. Wie IRSp53 die PSD erreicht, ist nicht eindeutig geklärt. Es gibt widersprüchliche Ergebnisse, ob die synaptische Lokalisierung des Proteins einen Stimulus wie NMDA braucht und welche Domänen relevant sind. In dieser Arbeit wurde zunächst der Einfluss von NMDA auf die Rekrutierung von IRSp53 untersucht. Dabei zeigte sich, dass in einem neuronalen Zellkulturmodell IRSp53 auch ohne besonderen Stimulus und trotz Blockade der neuronalen Aktivität bereits postsynaptisch lokalisiert ist. Im nächsten Schritt wurden in vier Domänen von IRSp53 Missense-Mutationen eingefügt, sodass je eine Domäne die Bindefähigkeit zu ihren Binderpartnern verloren hatte. Diese mutierten Proteine wurden mittels Expression durch Lentiviren in primär kultivierte Neuronen eingebracht. In protein¬biochemischen und immunzyto¬chemischen Analysen zeigte sich, dass die Domänen IMD, CRIB und das PDZ-BM für die korrekte Lokalisierung benötigt werden, die SH3-Domäne dagegen nicht. Daraus ergibt sich ein Modell, dementsprechend IRSp53 zunächst inaktiv und durch eine intra¬molekulare Bindung auto-inhibiert ist. Erst nach Aktivierung wird das Protein korrekt in der PSD lokalisiert. Die Aktivierung erfolgt durch Bindung von Cdc42 an das CRIB-Motiv. Dadurch kommt es vermutlich zu einer Konformationsänderung des Proteins, sodass die SH3-Domäne sich vom N-Terminus löst. Die IM-Domäne fixiert infolgedessen über Bindung an F-Actin bzw. die Phospholipidmembran und das PDZ-Bindemotiv über Bindung an PSD-95 und LIN7 IRSp53 in der Synapse. Gleichzeitig wäre auch die SH3-Domäne frei, Effektorproteine zu binden, wodurch IRSp53 womöglich wiederum Einfluss auf die Signaltransduktion und synaptische Plastizität haben könnte.
Kurzfassung auf Englisch: Learning is one of the most important aspects of human existence. As can be seen in neurological disorders as Alzheimer’s dementia one cannot live autonomously without memory. The molecular and cellular equivalent of learning is synaptic plasticity. Synaptic plasticity is mainly based on events that take place in the post-synaptic density (PSD). The PSD of a neuron constitutes the specialized part of the postsynaptic region of an excitatory synapse. It contains neurotransmitter receptors, proteins necessary for postsynaptic signal transduction and associated scaffold proteins. One important component of the PSD is the Insulin receptor substrate protein of 53kDa (IRSp53). Genetic studies have detected a link between IRSp53 and various neurological disorders such as Alzheimer’s and autism. As a multi-domain protein IRSp53 plays an important role as mediator between GTPases and the rearrangements of the actin cytoskeleton. So far, it is not clear how IRSp53 reaches the PSD. Results of previous studies are inconsistent with respect to the critical domains for recruitment of IRSp53 into the PSD or whether stimulation of NMDA receptors is needed. Here, the influence of NMDA on recruitment of IRSp53 into the PSD was examined. The data show that IRSp53 is already present in the PSD without stimulation and even despite blocking of neuronal activity with TTX. Next, four mutant variants of IRSp53 were developed, each lacking the ability to bind the partner proteins of one particular domain. Mutant proteins were introduced into neuronal cell culture using lentiviral vectors. Western blot analysis of purified PSD proteins and immunocytochemical examination showed an attenuated PSD accumulation when the IMD, CRIB or PDZ-BM were mutated. On the other hand, the SH3 domain does not seem to be required. This results in a model with IRSp53 initially being inactive and auto-inhibited by an intra-molecular bond. It is not until activation that IRSp53 localizes correctly in the PSD. Cdc42 starts this activation by binding to the CRIB domain. Thus, the conformation of IRSp53 changes and the SH3 domain dissociates from the N-terminal end. Hence, the IMD binds to F-Actin and the phospholipid membrane. IMD and PDZ-binding motif would therefore be able to bind PSD-95 and LIN7. Each of the interactions could tether IRSp53 postsynaptically. Also, the SH3 domain would be free to bind effector proteins. This again might influence signal transduction and synaptic plasticity.

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