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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-72977
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7297/


Generation and analysis of a cell-based model of CLN7 disease

Generierung und Analyse eines zellbasierten Modells für die CLN7-Erkrankung

Galal, Jana

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Basisklassifikation: 44.77
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Storch, Stephan (PD Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.03.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 07.05.2015
Kurzfassung auf Englisch: 1. Quantitative real-time PCR analyses showed low abundance of MFSD8/CLN7 mRNA in cultured HEK293 and HeLa cells. MFSD8/CLN7 mRNA expression was 8-fold higher in the human kidney derived cell line HEK293 compared to the HeLa cell line.

2. Comparison of siRNA- and shRNA-mediated down-regulation of MFSD8/CLN7 mRNA in HeLa and HEK293 revealed a higher reduction by shRNAs resulting in a decrease of MFSD8/CLN7 mRNA by 75% after 96 hours of expression compared to scrambled shRNA transfected cells.

3. Quantitative real-time PCR analyses of NCL-related and lysosomal genes in MFSD8/CLN7-depleted HeLa and HEK293 cells showed a reduction of CLN3, CLN6 and CLN8 mRNA levels. No significant changes in mRNAs coding for lysosomal proteins LAMP-1, lysosomal acid phosphatase, and cathepsin D in MFSD8/CLN7 down-regulated cells were detected suggesting no global transcriptional activation of lysosomal genes by TFEB in cells with short-term depletion of CLN7.

4. Endocytosis of the transferrin receptor at the cell surface and transport of transferrin-transferrin receptor complexes to endosomal compartments were unaltered in MFSD8/CLN7-downregulated HeLa cells.

5. In MFSD8/CLN7-depleted HEK293 cells decreased LAMP-1 and unaltered LAMP-2 protein levels were observed. In down-regulated HeLa cells amounts of LAMP-1 and LAMP-2 were unchanged and no gross changes in the number, size and distribution of LAMP-1 and LAMP-2 positive compartments were observed.

6. Biosynthetic sorting and processing of cathepsin D and cathepsin Z were unchanged in MFSD8/CLN7-depleted HeLa cells indicating that intracellular transport to lysosomes and lysosomal acidification were not impaired due to loss of CLN7.

7. Increased LC3-II amounts and an elevated number of autophagosomes in MFSD8/CLN7-depleted HEK293 and HeLa cells indicate an impairment of macroautophagy. Unaltered beclin amounts showed that macroautophagy was not induced due to loss of CLN7.

8. In summary, the cell-based model for CLN7 disease generated by shRNA-mediated depletion did not replicate all changes observed in Cln7-deficient fibroblasts of a knockout mouse model for CLN7 disease. However, an increased number of autophagosomes was detected in CLN7-depleted cells making the cell-based model for CLN7 disease suitable to study macroautophagy. The data suggest that both the cell type and the duration of CLN7 deficiency contribute to the pathological phenotypes observed in CLN7 disease. In addition, residual amounts of wild type CLN7 protein may lead to the absence or later onset of cellular phenotypes.
Kurzfassung auf Deutsch: 1. Die quantitative real-time PCR Analyse zeigte eine geringe MFSD8/CLN7 mRNA Expression in kultivierten HEK293 und HeLa Zellen. Die MFSD8/CLN7 mRNA expression war achtfach höher in den aus der Niere stammenden HEK293 Zellen im Vergleich zu der HeLa-Zelllinie.

2. Der Vergleich der siRNA- und shRNA-mediierten Herunterregulierung von MFSD8/CLN7 mRNA in HeLa und HEK293 zeigte eine höhere Reduktion durch shRNAs mit einer MFSD8/CLN7 mRNA Herunterregulierung bis zu 75% nach 96 Stunden im Vergleich zu Zellen, welche mit SCR shRNA transfiziert waren.

3. Die quantitative real-time PCR Analyse der NCL-bezogenen und lysosomalen Gene in MFSD8/CLN7-herunterregulierten HeLa und HEK293 Zellen zeigte eine Reduktion von CLN3, CLN6 und CLN8 auf mRNA Ebene. Es wurden keine signifikanten Veränderungen der mRNAs, die für die lysosomalen Proteine LAMP-1, lysosomale saure Phosphatase, und Cathepsin D in MFSD8/CLN7 herunterregulierten Zellen nachgewiesen. Dies suggeriert, dass keine globale transkriptionelle Aktivierung der lysosomalen Gene durch TFEB in den kurzzeitig CLN7-depletierten Zellen stattgefunden hat.

4. Die Endozytose des Transferrinrezeptors an der Zelloberfläche und der Transport des Transferrin-Transferrinrezeptor Komplexes zu den endosomalen Kompartimenten war unverändert in MFSD8/CLN7-herunterregulierten HeLa Zellen.

5. Es zeigte sich eine reduzierte LAMP-1 und eine unveränderte LAMP-2 Proteinmenge in MFSD8/CLN7-depletierten HEK293 Zellen. In MFSD8/CLN7-depletierten HeLa Zellen zeigten sich unveränderte LAMP-1 und LAMP-2 Mengen. Außerdem war die Anzahl, die Größe und das Verteilungsmuster der LAMP-1 und LAMP-2 positiven Kompartimente unverändert.

6. Die biosynthetische Sortierung und Prozessierung von Cathepsin D und Cathepsin Z war in MFSD8/CLN7-depletierten HeLa Zellen unverändert. Dies spricht dafür, dass der intrazelluläre Transport zu den Lysosomen und die lysosomale Azidifizierung durch den CLN7-Mangel nicht beeinflusst wurde.

7. Es zeigten sich erhöhte LC3-II Proteinmengen und eine erhöhte Anzahl an Autophagosomen in MFSD8/CLN7-depletierten HEK293 und HeLa Zellen. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die Autophagie beeinträchtigt war. Unveränderte Beclinmengen sprechen dafür, dass die Makroautophagie nicht durch den Verlust an CLN7 induziert wurde.

8. Zusammenfassend zeigen die oben genannten Ergebnisse, dass das mittels shRNA generierte zellbasierte Modell nicht alle Veränderungen, welche in Cln7-defizienten Fibroblasten des knockout Mausmodells gesehen wurden, repliziert hat. Dennoch zeigte sich eine erhöhte Anzahl an Autophagosomen in CLN7-depletierten Zellen, wodurch dieses zellbasierte Modell für eine genauere Analyse der Makroautophagie geeignet scheint. Die Ergebnisse suggerieren, dass sowohl der Zelltyp als auch die Dauer der CLN7-Depletion für die pathologische phänotypsiche Entwicklung bei der CLN7 Erkrankung eine Rolle spielen. Zudem kann die restliche CLN7 Proteinmenge zu einem Ausbleiben oder verspäteten Entwicklung des zellulären Phänotyps führen.

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