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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-73014
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7301/


Neuroprotektion von Photorezeptoren mit lentiviral transduzierten mesenchymalen Stammzellen in dem Pde6b rd1 Mausmodell

Neuroprotection of Photoreceptors with lentiviral transduced mesenchymal stemcells in a Pde6b rd1 mousemodel

Singh, Preet Mohinder

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Stammzellen , mesenchymale , Transduktion , Photorezeptoren , Virus
Basisklassifikation: 44.95
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bartsch, Udo (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.03.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 05.05.2015
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob über intravitreale Transplantationen von genetisch modifizierten mesenchymalen Stammzellen mit einer ektopischen Expression von „ciliary neurotrophic factor“ die Degeneration von Photorezeptoren in einem Mausmodell für autosomal rezessive Retinitis pigmentosa verzögert werden kann. Dazu wurden mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark von EGFP-transgenen Mäusen isoliert und die Zellen mit einem polycistronischen lentiviralen Vektor transduziert, der für den neuroprotektiven Faktor CNTF, das Reportergen tdTomato und das Resistenzgen Blasticidin kodiert. Erfolgreich transduzierte Zellen wurden durch Gabe des Antibiotikums selektioniert, und aus den resultierenden „bulk“ Kulturen wurden klonalen Stammzelllinien mit einer starken Expression von CNTF abgeleitet. Dazu wurde ausgenutzt, dass die Expressionsstärke von CNTF und dem Reportergen tdTomato von dem polycistronischen Vektor proportional zueinander sind. Über „fluorescence activated cell sorting“ (FACS) wurden daher einzelne Zellen mit einer starken Expression des Reportergens selektinoniert und anschliessend klonal expandiert. Analysen solcher klonalen Zelllinien zeigten, dass in den Kulturen mit einer höheren Expression des Reportergens auch eine erhöhte Expression von CNTF zu beobachten war. Mesenchymale Stammzellen für Kontrollexperimente wurden mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der für das Reportergen tdTomato und das Resistenzgen Blasticidin kodiert. Klonale Zelllinien mit einer starken Expression des Reportergens wurden aus diesen Kulturen wie oben beschrieben mittels FACS abgeleitet.
Um das neuroprotektive Potential der CNTF-exprimierenden klonalen mesenchymalen Stammzelllinien in vivo zu analysieren, wurden die Zellen intravitreal in die Pde6brd1 Mutante transplantiert, einem Tiermodell für autosomal rezessive Retinitis pigmentosa. Als Kontrolle wurden in die jeweils kontralateralen Augen intravitreal die Kontrollzellen transplantiert. Die Zelltransplantationen wurden zu Beginn der Photorezeptordegeneration am postnatalen Tag 8 durchgeführt. Die Netzhäute wurden am postnatalen Tag 15 analysiert, ein Alter, zu dem in unbehandelten Pde6brd1 Mutanten fast alle Photorezeptoren degeneriert sind. Zur Abschätzung des neuroprotektiven Effekts wurden in zentralen Netzhautschnitten an definierten Stellen die Photorezeptoren ausgezählt. Die Analyse ergab, dass in den CNTF-behandelten Augen signifikant mehr Photorezeptoren vorhanden waren als in den kontralateralen Kontrollaugen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass über intravitreale Transplantationen von genetisch modifizierten mesenchymalen Stammzellen funktionell relevante Mengen von neuroprotektiven Faktoren in dystrophe Netzhäute eingeschleust werden können.

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