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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-74594
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7459/


Entwicklung von Methoden zur Isolation von Murinen Retinalen Pigmentepithelzellen

Development of Methods for the Isolation of Mouse Retinal Pigmented Epithelial Cells

Brolund, Allan

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Isolation , RPE , Murinen , Zellkultur , Einzelzellen
Freie Schlagwörter (Englisch): Isolation , Mouse , Culture , RPE
Basisklassifikation: 44.37
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Strauß, Olaf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.06.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 31.07.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Einzelzellschicht, die zwischen den Photorezeptoren und der Bruchschen Membran in der hinteren Augenkammer lokalisiert ist. Das RPE hat zahlreiche Funktionen wie die Absorption von Licht, den Transport von Ionen und Wasser, Nährstoffen und Stoffwechselprodukten. Weiterhin sezerniert das RPE verschiedene Wachstumsfaktoren sowie immunmodulierende Faktoren. Ein Versagen in der Ausführung der verschiedenen Tätigkeiten des RPEs kann zu unterschiedlichen Photorezeptordegenerationen bis hin zum Verlust der Sehkraft führen. Auch wenn die Erforschung des RPEs in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht hat, so sind zahlreiche physiologische und pathophysiologische Funktionen nach wie vor unverstanden. Diese Funktionen sind jedoch für das Verständnis von retinalen Erkrankungen wie z.B. retinale Degeneration sowie für die Entwicklung von gezielten Therapien von großer Bedeutung. Die existierende Literatur bezieht sich zu einem großen Teil auf Daten, die durch die Erforschung von RPE-Zellen von Ratten und Zelllinien gewonnen wurden. Viele Pathologien werden jedoch in Form von genetisch veränderten Mausmodellen nachvollzogen. Die wachsende Anzahl von Mausmodellen für retinale Erkrankungen sowie Mausmodelle mit gezielten genetischen Veränderungen zum Studium bestimmter Signalkaskaden wird das Studium der Zellfunktionen des RPE sowie dessen Beteiligung bei retinalen Erkrankungen ermöglichen. Dabei ist die Isolierung von RPE-Zellen aus Mäusen die entscheidende Methode zur Entwicklung von bestehenden und neuen Modellen. Ziel: Das Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer Methode zur Isolation von murinen RPE-Zellen, um sie der Forschung für die Untersuchung verschiedener biologischer Fragestellungen mittels diverser Zellfunktionsmessungen zugänglich zu machen. Methoden: Es wurden unterschiedliche Methoden zur Zellisolierung herangezogen und systematisch für eine Optimierung modifiziert. Hierzu gehörten unter anderem: Vorbehandlung mit unterschiedlichen Lösungen, Calciumentzug, enzymatische Behandlung und mechanische Manipulation. Ergebnisse: In meiner Arbeit entwickelte ich Methodenprotokolle zur Isolation von RPE Zellen der Maus. Die entwickelten Protokolle ermöglichen mit reproduzierbarem Erfolg die Isolierung von frischen RPE-Einzelzellen sowie frischer nativer RPE-Zellverbände und damit die Untersuchung von RPE-Zellfunktionen sowohl auf Einzelzellebene als auch auf der Ebene des Zellverbandes und der Zellkultur. Weiterhin können beide Präparationen auch als Zellkulturen ex vivo kultiviert und für weitere Untersuchungen genutzt werden. Diskussion: Die Entwicklung der Isolationsprotokolle ermöglicht die Herstellung von RPE-Einzelzellen, nativer RPE-Zellverbände und RPE-Zellen zur Herstellung von RPE-Zellkulturen. Die Proliferationsfähigkeit der isolierten RPE-Zellen in der Zellkultur ist gegeben, jedoch limitiert, sodass für größere Kulturen größere Mengen an Bulbi verarbeitet werden müssen. Die jeweiligen Endprodukte konnten in unserem Labor für die Untersuchung mit verschiedenen Techniken, z.B. Messung von Ionenkanalströmen mittels Patch Clamp, Immuncytochemie und transepitheliale Widerstandsmessungen genutzt werden. Viele Pathologien werden in Form von genetisch veränderten Mausmodellen nachvollzogen. Die Existenz dieser Mausmodelle ermöglicht in Kombination mit der entwickelten Isolationsmethode weitere Ansätze zur Erforschung der bekannten Pathologien. So können Prozesse wie die RPE-Sekretion und immunologische Prozesse untersucht werden.

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