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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-74727
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7472/


Strukturelle Charakterisierung von Proteinen onkolytischer Viren

Structural Characterization of Proteins from Oncolytic Viruses

Klinge, Marco

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Viren , Struktur , Biochemie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Onkolytische Viren
Freie Schlagwörter (Englisch): Oncolytic Viruses
Basisklassifikation: 42.13 , 42.12
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Redecke, Lars (Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.07.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 30.07.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Onkolytische Viren, wie das H-1 Parvovirus (H-1PV), stellen vielversprechende Alternativen für die Behandlung von Tumorerkrankungen dar, da sie in der Lage sind, selektiv in entarteten Zellen zu replizieren und diese zu abzutöten, ohne dabei gesundes Gewebe zu beeinträchtigen. Für H-1PV wurde das multifunktionelle Nichtstrukturprotein 1 (NS1) als Basis für den Onkotropismus identifiziert, welches aus mehreren Domänen besteht und neben seiner zentralen Rolle für die virale Replikation in der Lage ist, molekulare Interaktionen mit verschiedenen, oft hochregulierten Replikationsfaktoren der Tumorwirtszelle einzugehen. Diese Interaktionen resultieren in einer tumorspezifischen NS1-vermittelteten Zytotoxizität, deren molekulare Basis jedoch bisher vor allem aufgrund des Fehlens hochauflösender Strukturdaten nicht vollständig verstanden ist.
In dieser Arbeit wurde die Grundlage für die strukturelle Untersuchung der einzelnen NS1-Domänen nach bakterieller Expression geschaffen, wobei sich die N-terminale Nukleasedomäne (NS11-265) als geeignete Zielstruktur herausstellte. Diese Nuklease der HUH-Familie katalysiert die spezifische Spaltung der viralen DNA während der rolling hairpin Replikation und ist damit für den Lebenszyklus des Virus essentiell. Nach löslicher Expression und Reinigung konnte NS11-265 erfolgreich kristallisiert und ein Strukturmodell mit einer maximalen Auflösung von 2.8 Å postuliert werden, das eine signifikante Übereinstimmung mit der bereits strukturell aufgeklärten homologen Nukleasedomäne des minute virus of mice (MVM) aufweist. Das Strukturmodell zeigt deutlich das konservierte HUH-Motiv, das für die Bindung eines zweiwertigen Kations (Me2+) verantwortlich ist. Dies ist für die Nukleaseaktivität von NS11-265 essentiell, da es die Nukleophilie des katalytischen Tyr 210 für den Angriff auf das Phosphatrückgrat erhöht. Durch Microscale Thermophorese (MST) sowie isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) konnte erstmals nachgewiesen werden, dass Mn2+, jedoch nicht Mg2+ an das HUH-Motiv von NS11-265 bindet und zur Aktivierung der Nukleasefunktion führt. Ferner konnte mittels Kleinwinkelstreuung (SAXS) eine spezifische, aber bisher völlig unbekannte Konformationsänderung nach Bindung von Mn2+ beobachtet werden, was höchstwahrscheinlich durch den Übergang in die aktive Form des Enzyms begründet ist. Basierend auf den hier präsentierten Daten wird Mn2+ als essentieller nativer Cofaktor für die Nukleaseaktivität von H-1PV NS11-265 postuliert.
Ein weiteres onkolytisches Protein ist das Apoptin aus dem Hühner-Anämie-Virus (CAV, aus engl. chicken anemia virus), dessen Co-Expression mit H-1PV NS1 in vorherigen Studien zu einem verstärkten onkolytischen Effekt in einer Vielzahl von Tumorzelllinien führte und deshalb in dieser Arbeit ebenfalls strukturell untersucht wurde. Apoptin konnte in Fusion mit dem Maltose-bindenden Protein (MBP-Apoptin) löslich hergestellt und gereinigt werden und bestätigte die durch vorherige Publikationen bereits gezeigte Ausbildung eines spezifischen Oligomers. Mit Hilfe eines SAXS-Modells konnte gezeigt werden, dass der MBP-Apoptin-Komplex ein ringförmiges Hexadekamer ausbildet, was die erste Strukturinformation dieses Proteins in Lösung darstellt.
Da jedoch weder für Apoptin noch für die weiteren NS1-Domänen Proteinkristalle durch Anwendung der etablierten Kristallisationstechniken gebildet werden konnten, wurde die Möglichkeit der kürzlich publizierten intrazellulären Proteinkristallisation in Sf9-Zellen als alternativer Ansatz untersucht. Nachdem initiale in vivo-Kristallisationsversuche nicht erfolgreich waren, wurden am Beispiel von Cathepsin B aus Trypanosoma brucei (TbCatB), dessen hochauflösende Struktur aus intrazellulären Proteinkristallen bereits generiert werden konnte, sowie von GFP-µNS aus dem avianen Reovirus, die zellulären Grundlagen für die Kristallisation in lebenden Sf9-Zellen näher untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass TbCatB im endoplasmatischen Retikulum kristallisiert, während die Kristallisation von GFP-µNS im Zytosol der Sf9-Zellen stattfindet. Folglich könnte das Kompartiment der Sf9-Zelle einen ersten wichtigen Parameter zur Erhöhung des intrazellulären Kristallisationserfolgs auch für weitere Proteine darstellen. Des Weiteren wurde für isolierte Kristalle eine starke Stabilitätsabhängigkeit vom verwendeten Lysis- und Lagerungspuffer nachgewiesen, was den Bedarf an neuen Ansätzen zur Etablierung optimaler Messbedingungen für intrazelluläre Proteinkristalle verdeutlicht. Ein besseres Verständnis der intrazellulären Proteinkristallisation sowie die Optimierung der Kristallstabilität werden neue Möglichkeiten zur strukturellen Aufklärung von Proteinen onkolytischer Viren bieten, die bisher mit klassischen Ansätzen nicht kristallisiert werden konnten. Die Strukturaufklärung dieser Proteine wird essentiell sein, um die Entwicklung innovativer Therapien in der Behandlung von Tumorerkrankungen zu ermöglichen
Kurzfassung auf Englisch: Oncolytic viruses, e.g. the H-1 parvovirus (H-1PV), represent promising candidates for the treatment of cancer due to their selective replication in transformed cells, thus leading to tumor cell death without harming healthy tissue. For H-1PV the multidomain and multifunctional nonstructural protein 1 (NS1) was identified to be the basis of the selective oncotropism, featuring pivotal functions for viral replication. Additionally, NS1 interacts with frequently upregulated replication factors of the tumor cell, thus leading to NS1-induced cytotoxicity. However, due to the lack of high-resolution structural information the precise molecular basis for the oncoselectivity of NS1 remains elusive so far.
This work provides the required basis for the structural characterization of the individual NS1 domains, identifying the N-terminal nuclease domain (NS11-265) as a suitable target for structural characterization. This nuclease domain catalyzes the nicking of the dsDNA during viral rolling hairpin replication, thus playing a pivotal role within the viral life cycle. Successful protein crystallization of NS11-265 led to the proposal of a structural model at 2.8 Å resolution, which reveals significant structural similarity with that of the homologue minute virus of mice (MVM) NS11-255, also featuring the conserved HUH metal binding site. Metal binding is required to increase the nucleophilicity of the active Tyr-210 residue, thus providing an essential function of the protein. Microscale thermophoresis (MST) and isothermal titration calorimetry (ITC) clearly identified that Mn2+, but not Mg2+ specifically binds to the NS11-265 HUH-motif with nanomolar affinity, triggering its specific nuclease activity. In addition, small angle x-ray scattering (SAXS) experiments revealed the induction of a conformational rearrangement upon Mn2+ binding, converting NS11 265 into its active form. Thus, Mn2+ is suggested to act as the native cofactor for the H1-PV nuclease domain for the first time.
Another oncolytic viral protein is apoptin from chicken anemia virus, which has been shown to increase H-1PV NS1 cytotoxicity in a variety of tumor cells. Apoptin was expressed and purified fused to maltose binding protein (MBP), forming a specific oligomer in solution that was characterized by dynamic light scattering experiments, consistent with previously published results. Applying SAXS techniques, an initial low-resolution model of the MBP-apoptin complex was calculated, indicating a ring-shaped symmetric hexadecamer structure with an apoptin core surrounded by the MBP domains of each molecule.
Since conventional crystallization of apoptin and further NS1 domains could not be established so far, the possibility for intracellular protein crystallization in Sf9 insect cells was initially tested as an alternative approach, however, without any success. Therefore, the cellular basis for this phenomenon was further investigated using intracellularly grown TbCatB crystals, recently reported to be suitable for structural biology at free electron lasers (FEL) and synchrotron sources, and GFP-µNS from avian Reovirus as representative examples. For TbCatB, fluorescence microscopy experiments clearly revealed the endoplasmic reticulum to be the cellular compartment of crystal formation, while GFP-µNS is supposed to crystallize from the cytosol of the Sf9 cell. Thus, the cellular compartment is suggested to represent an essential parameter for successful intracellular protein crystallization. Furthermore, crystal stability was shown to be strongly dependent on the used buffer, emphasizing the need for new strategies optimizing crystal stability and diffraction quality.
An improved understanding of the mechanisms underlying intracellular crystal formation may open new routes for the structural elucidation of proteins that are difficult to crystallize applying conventional approaches so far, especially proteins from oncolytic viruses. A better understanding of the molecular basis leading to oncoselectivity will finally provide new approaches for the development of antitumoral therapies.

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