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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-74802
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7480/


Investigations on an Innovative Antibiotic Approach : Structure-Function-Analysis of Essential Enzymes Routing the Vitamin B1 de novo Biosynthesis and Vitamin B6 Salvage Pathway of Staphylococcus aureus

Analyse eines innovativen antibiotischen Prinzips : Struktur-Funktionsanalyse von essentiellen Enzymen des Vitamin B1 de novo Biosyntheseweges und des Vitamin B6 Recyclings von Staphylococcus aureus

Künz, Madeleine

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SWD-Schlagwörter: Staphylococcus aureus , MRSA , Vitamin B1 , Vitamin B6 , Kristallisation , Wirkstoff
Freie Schlagwörter (Deutsch): Thiamin
Freie Schlagwörter (Englisch): Staphylococcus aureus , MRSA , vitamin B1 , vitamin B6 , crystallography , drug development
Basisklassifikation: 42.12 , 35.74 , 44.75
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.07.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 31.07.2015
Kurzfassung auf Englisch: Just 72 years after the mass production of the first broad spectrum antibiotic penicillin started Staphylococcus aureus represents a dismaying global threat again. In the golden era of the antibiotic development the drug pipeline fighting this and other human pathogenic bacteria was filled repeatedly to combat the ongoing bacterial resistant development and spread. However, in the late 1980’s an ongoing discovery void in antibiotic development began, missing innovative novel targets, and the risk of entering a post-antibiotic era is evident these days.
In this study a promising new strategy is presented, which uses the bacterial vitamin B1 de novo biosynthesis, that is entirely absent in humans. In the course of this approach substrate analogs, also termed ‘suicide drugs’ are channeled into the bacterial metabolism and will finally, after a set of metabolization steps, block a specific variety of cofactor dependent enzymes inside the bacterium as an inactive cofactor. This uncouples the site of drug infiltration and target action and entails multiple downstream effects.
The structure of S. aureus ThiM in complex with two of these substrate analogs was solved via X-ray crystallography. Furthermore ThiM was successfully evaluated for its binding of NPE-caged ATP via STD-NMR, which could serve, in combination with an initially controlled rational crystallization conducted in the XtalController900, as a serial X-ray crystallographic pump-probe approach in future. Additionally, the mode of action of a former identified inhibitor of ThiM was elucidated. Moreover, the structure of TPK in complex with its natural ligand thiamine was solved. This allowed the analysis of possible thiamine analogs, build up out of the two promising substrate analogs studied for ThiM, incorporation.
Furthermore, the structures of S. aureus and the monocellular eukaryotic protozoan Trypanosoma cruzi vitamin B6 kinase – PdxK were solved to high resolution via X-ray crystallography and S. aureus PdxK structure was analyzed in solution via small angle X-ray scattering. The structural analysis allowed the differentiation of PdxK, which also shows promiscuous activity towards the first substrate of the kinase ThiD, which is an essential kinase for the HMP feeding into the vitamin B1 metabolism in S. aureus. Based on these results the interplay of the metabolisms and the structural delimitation can now be further studied and will highlight the evolutionary relations.
Beyond that, a pepdimometic approach targeting PdxK could be followed on basis of the crystallization result of S. aureus PdxK and could reveal an innovative possibility of inhibiting these kinases. Furthermore, an additional expression system using insect cells was tested and all proteins of the vitamin B1 and B6 pathways were successfully produced. In summary this work provides valuable information for the development of innovative antibiotic substances based on proteins’ structural data to specifically target MRSA.
Kurzfassung auf Deutsch: Nur 72 Jahre nach Beginn der Massenproduktion des ersten Breitbandantibiotikums Penicillin stellt Staphylococcus aureus wieder eine kritische globale Bedrohung dar. Im goldenen Zeitalter der Antibiotikaentwicklung wurde die Medikamenten-Pipeline zur Behandlung dieses und anderer humanpathogener Bakterien regelmäßig gefüllt, um der Entwicklung und Verbreitung bakterieller Resistenzen begegnen zu können. Seit Ende der 1980er Jahre hingegen ist die Entwicklung in der Antibiotikaforschung defizitär und innovative Targets fehlen, sodass heute das Risiko einer post-antibiotischen Ära evident ist.
Diese Arbeit präsentiert eine neue, aussichtsreiche Strategie, die auf die bakterielle Vitamin B1 (Thiamin) de novo Biosynthese, welche beim Menschen nicht vorkommt, abzielt. Hierzu werden Substrat-Analoga - „Suicide Drugs“ - in den bakteriellen Metabolismus eingeschleust und führen letztlich, nach mehreren Metabolisierungsschritten als inaktive Co-Faktoren zur Blockade multipler Co-Faktor-abhängiger Enzyme im Bakterium. Auf diese Weise werden der Wirkstoff-Eintrittsort und der Wirkort voneinander entkoppelt.
Die Struktur von S. aureus ThiM im Komplex mit zweien dieser Substrat-Analoga konnte via Protein-Kristallographie bestimmt werden. Außerdem konnte ThiM erfolgreich auf sein Potenzial, NPE-caged ATP via STD-NMR zu binden, untersucht werden. Dieses könnte zukünftig - in Kombination mit dem evaluierten, kontrollierten Kristallisierungs-Setup mittels XtalController900 - für serielle röntgenkristallographische Pump-Probe-Experimente genutzt werden. Zusätzlich konnte die Wirkungsweise eines bereits zuvor identifizierten Inhibitors von ThiM näher analysiert werden.
Des Weiteren wurde die Struktur von TPK im Komplex mit seinem natürlichen Liganden mittels Protein-Kristallographie gelöst. Auf dieser Basis konnte die Akzeptanz möglicher Thiamin-Analoga, hergestellt aus den zwei für ThiM untersuchten Substrat-Analoga, strukturell untersucht werden.
Weiterhin wurde die Struktur der Vitamin B6 Kinase (PdxK) aus S. aureus und des eukaryotischen Protozoen Trypanosoma cruzi mittels Protein-Kristallographie gelöst und zusätzlich die S. aureus PdxK Struktur in Lösung mittels SAXS überprüft.
Die strukturelle Analyse erlaubt nun die Untersuchung der Substratspezifität von PdxK, welche gegenüber dem ersten Substrat (HMP) der Kinase ThiD, das die HMP-Zufuhr im Vitamin B1 Metabolismus in S. aureus sicher stellt, ebenfalls Aktivität zeigt. Auf Basis dieser Ergebnisse kann nun das Zusammenspiel des B1 und B6 Metabolismus sowie die strukturelle Differenzierung weiter untersucht und die evolutionären Verbindungen analysiert werden.
Darüber hinaus kann auf Basis der Kristallisationsergebnisse von S. aureus PdxK ein auf PdxK zielender pepdimometischer Ansatz verfolgt werden und innovative Möglichkeiten der Blockade dieser spezifischen Kinasen bieten. Ferner wurde zusätzlich ein Expressionssystem unter Nutzung von Insektenzellen getestet, bei welchem sämtliche S. aureus Proteine des Vitamin B1 Metabolismus und PdxK erfolgreich produziert werden konnten. Zusammenfassend bietet diese Arbeit wertvolle Informationen für die rationale Entwicklung innovativer antibiotischer Substanzen basierend auf strukturellen Daten, um MRSA spezifisch zu targetieren.

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