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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-75010
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7501/


Die Bedeutung des Exocyst-Komplexes bei der Phagosomenreifung in Endothelzellen

Rauch, Liane

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Endothelzellen , Exocyst , Phagosomenreifung , Recycling Endosomen
Freie Schlagwörter (Englisch): endothelial cells , exocyst , phagosome maturation , recycling endosomes
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Aepfelbacher, Martin (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.07.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 25.08.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Endothelzellen kleiden als einlagige Zellschicht alle Blut- und Lymphgefäße aus und stellen somit eine wichtige Barriere zwischen dem intravaskulären und extrazellulären Raum dar. Durch ihre Lage besitzen sie auch eine zentrale Bedeutung in der Abwehr von Mikroorganismen. Obwohl Endothelzellen zu den „nicht-professionellen“ Phagozyten zählen, besitzen sie eine hohe bakterizide Aktivität. Nach Internalisierung von Mikroorganismen werden diese in endothelialen Phagosomen eingeschlossen, welche nach Interaktion mit Bestandteilen des Endo-Lysosomalen Kompartiments zu Phagolysosomen reifen und ihren bakteriellen Inhalt degradieren. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von Phagosomen mit Proteinen des Exocyst-Komplexes in Endothelzellen untersucht und die Beteiligung dieses tethering-Komplexes bei der Reifung der Staphylokokken- und Polystyrol-Kügelchen-haltigen Phagosomen charakterisiert. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden wurde die Interaktion von Exocyst-Proteinen (Sec5, Sec8, Sec10 und Exo70) und Markerproteinen für recycling endosomes, Rab11 und Transferrin-Rezeptor, mit Phagosomen verschiedener Reifestadien nachgewiesen. Durch knockdown der Exocyst-Proteine, Sec8 und Exo70, wurde eine verringerte Akkumulation von Rab11-positiven Vesikeln am Phagosom detektiert, wodurch maßgeblich die phagosomale Reifung beeinträchtigt wurde. Besonders deutlich konnte der Einfluss des Exocysten und der recycling endosomes auf die Phagosomenreifung durch Untersuchung der Ansäuerung der Phagosomen dargestellt werden. So führte die Depletion von Rab11 und Exocyst-Proteinen zu einer verminderten Ansäuerung der Phagosomen. Vermutlich dadurch wurde ebenfalls die Rekrutierung des phagolysosomalen Markerproteins Lamp1 zum Phagosom reduziert. Aufgrund der oben aufgezeigten Ergebniskette ergab sich als Konsequenz, dass der knockdown von Exocyst und recycling endosomes eine signifikante Beeinträchtigung des Abbaus von invadierten Staphylokokken in Endothelzellen hervorrief. Interessanterweise konnte der inhibitorische Einfluss von Exo70 auf die bakterielle Degradationsleistung durch Überexpression von konstitutiv-aktivem Rab11 (Rab11-Q70L) erfolgreich aufgehoben werden. Die Daten dieser Arbeiten zeigen damit, dass der Exocyst-Komplex die Interaktion von recycling endocytic vesicles mit dem Phagosom steuert und dadurch maßgeblich die Reifung und Funktionsweise der Phagosomen in Endothelzellen beeinflusst.
Kurzfassung auf Englisch: Endothelial cells line the inner surface of all blood- and lymphatic vessels and thus represent a crucial barrier between the bloodstream and the surrounding tissue. Due to their localization, endothelial cells are also important for the cellular defense against microorganisms. Although they belong to the class of non-professional phagocytes, endothelial cells feature a high bactericidal activity. Internalized pathogens are enclosed in the endothelial cell phagosomes which mature via sequential interaction with components of the endo-lysosomal compartment and are finally degraded in the matured phagolysosomes. In this study, the interaction between phagosomes and the exocyst complex in endothelial cells was analyzed. Specifically, the role of this tethering complex during maturation of Staphylococci- and latex beads containing phagosomes was addressed. Using advanced imaging methods, the colocalization of exocyst proteins (Sec5, Sec8, Sec10 and Exo70) with marker proteins of recycling endosomes, Rab11 and transferrin receptor, was visualized during the phagosomal maturation process. A knockdown of the exocyst proteins Sec8 and Exo70 resulted in decreased accumulation of Rab11-positive vesicles at the phagosomes, which greatly reduced the phagosomal maturation. The strongest effect of the tethering proteins and recycling endosomes could be detected by analyzing the acidification of phagosomes. Knockdown of Rab11 and exocyst proteins reduced phagosomal acidification significantly and led to an impaired localization of Lamp1 to the phagolysosomes. As a consequence knockdown of exocyst and recycling endosomes significantly restrained elimination of internalized Staphylococci in endothelial cells. Intriguingly, the inhibition of bacterial degradation by Exo70 knockdown was rescued by the overexpression of a constitutively active Rab11 mutant (Rab11-Q70L). These results indicate that the exocyst complex controls the interaction of recycling endocytic vesicles with the phagosome and that this interaction is required for phagosome maturation in endothelial cells.

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