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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-75046
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7504/


Strukturelle Analyse der dynamischen Konformationsänderung des Prion-Proteins in Proteinmissfaltungskrankheiten

Structural analysis of dynamic conformational changes of prion protein in protein misfolding diseases

Sommer, Anne

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SWD-Schlagwörter: Prion , Ultraviolett-Bestrahlung , Oligomere , Inhibition , Peptide
Freie Schlagwörter (Deutsch): metallkatalysierte Umwandlung
Basisklassifikation: 35.79
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.08.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 28.08.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Prion-Proteine können durch eine Konformationsänderung, die beispielsweise oxidativ induziert werden kann, in ihre β-Faltblatt-reiche pathogene Isoform umgewandelt werden, welche als alleiniger Erreger der übertragbaren spongiformen Enzephalopathien angesehen wird. Eine hochauflösende Struktur der PrPSc-Isoform sowie detaillierte Kenntnisse über den Mechanismus der Umwandlung und deren Initialisierung sind bis heute nicht vorhanden, obwohl die Forschung auf diesem Gebiet sehr umfangreich ist.
Zur Gewinnung neuer Erkenntnisse wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst die Herstellung der Prion-Proteine optimiert, daraufhin ein UV-System zur oxidativ-induzierten Konformationsänderung etabliert und die Radienbestimmung von Proteinen mittels DLSSystem im Fluss untersucht. Während der UV-Bestrahlungsexperimente konnten neben der Bildung einer löslichen, oligomeren Spezies Aggregations-Intermediate detektiert werden, deren Herstellung für weitere Isolierungs- und Charakterisierungsexperimente optimiert wurde. Die Produktion der gewünschten Aggregations-Intermediate mittels UV-Bestrahlung war sowohl im Kreislaufsystem als auch im Durchflusssystem erfolgreich. Die anschließende Isolierung der hergestellten Spezies von den PrP-Monomeren unter Anwendung verschiedener biochemischer Trennmethoden blieb jedoch erfolglos, daher erfolgte die Charakterisierung mit den bestrahlten Mischfraktionen. Die Proben wurden mittels DLS, CD-Spektroskopie und nativer PAGE analysiert, dabei wurde deutlich, dass es sich bei den hergestellten AggregationsIntermediaten nicht um „dimere“ und „trimere“ Zwischenstufen handelt. Es konnte gezeigt werden, dass in der Proteinlösung nicht nur die in der SDS-PAGE-Analyse detektierten spezifischen Zwischenprodukte vorlagen und dass die erzeugten Spezies bereits diffuse oligomere Strukturen aufwiesen. Mit zunehmender Bestrahlungszeit und der Bildung höherer Aggregate entsprach der charakteristische Faltungszustand der Prion-Proteine nicht mehr dem der zellulären Form des Prion-Proteins. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die oxidativ-induzierte spezifische Umwandlung des Prion-Proteins nicht über einzelne spezifische Zwischenzustände verläuft, sondern von Anfang an diffuse oligomere Zustände aufweist, welche im weiteren Verlauf der oxidativen Schädigung kovalente Vernetzungen ausbilden und schließlich die löslichen, spezifischen Oligomere formen. Des Weiteren konnte die Inhibition der PrP-Aggregation durch spezifische Peptide nachgewiesen werden. Der inhibitorische Effekt konnte sowohl in einem etablierten oxidativen metallkatalysierten Assay als auch durch das UV-induzierte Umwandlungssystem bestätigt werden. Die Ergebnisse der CD-spektroskopischen Analysen deuten darauf hin, dass die vielversprechendsten Peptide das Prion-Protein in der zellulären, vorwiegend α-helikalen Form stabilisieren und dabei eine hohe Bindungsaffinität im µM-Bereich aufweisen. Diese Resultate müssen zukünftig verifiziert und vertieft werden, um detailliertere Erkenntnisse einerseits über den molekularen Ablauf des UV-induzierten Umwandlungsmechanismus von der zellulären Form des Prion-Proteins in seine pathogene Isoform und andererseits über die Bindung der inhibierenden Peptide als Grundlage zur Entwicklung eines Medikaments für Prionen-Erkrankungen zu liefern. Abschließend lässt sich festhalten, dass wichtige neue Einblicke in den UV-induzierten Umwandlungs- und Aggregationsmechanismus des Prion-Proteins gewonnen wurden und außerdem noch neue, vielversprechende Peptide identifiziert wurden, die möglicherweise zu effektiven PrP-Umwandlungsinhibitoren optimiert werden können.
Kurzfassung auf Englisch: Prion proteins can be converted by an oxidatively induced conformational change into a β-sheet enriched pathogenic isoform, which is considered to be the causative agent of transmissible spongiform encephalopathies. High-resolution structures of the PrPSc isoform as well as detailed knowledge of the fundamental mechanism that trigger the conversion and aggregation process of PrP have not been obtained so far, although extensive research has been performed during the past decade in this area.
To increase the current knowledge, the preparation protocol for recombinant prion protein was optimized in this work, followed by the establishment of an UV irradiation setup to induce conformational changes by oxidative damage of the PrP molecules. Moreover, an online DLS system was tested and applied to determine the radius of particles in solution directly in flow. In addition to the formation of a specific soluble oligomer species, different aggregation intermediates have been detected during UV irradiation experiments. The preparation of these intermediates has been optimized for isolation and further characterization experiments. The production of the required aggregation intermediates by UV irradiation was successful both in a circulation system and in a flow-through system. However, subsequent trials to isolate these species by different biochemical methods was not successful. Thus, the characterization was performed with the irradiated mixed fractions. Investigation of the intermediate samples by DLS, CD spectroscopy and native PAGE indicated that it was no "dimeric" and "trimeric" intermediate in the produced aggregation intermediates. It could be shown that there were not just the specific intermediates detected in the SDS-PAGE analysis of the protein solution, but that these generated species had already diffuse oligomeric structures. With increasing irradiation time and higher aggregates formation the characteristic folding state of the prion protein no longer corresponded to the cellular form of the prion protein. The results suggest that the oxidative-induced specific conversion of the prion protein does not have individual specific intermediate states runs. The first diffuse oligomeric states will be formed in the further course of oxidative damage, then covalent crosslinks and finally the specific soluble oligomer will be developed. Furthermore, specific and highly efficient inhibition of the PrP conversion and aggregation process was detected in the presence of specific peptides. The inhibitory effect was successfully confirmed by applying both metal-catalyzed and UV-induced oxidation of the PrP molecules. The results of the CD spectroscopic analysis suggest that the most promising peptides stabilize the prion protein in the cellular, predominantly α-helical fold, exhibiting binding affinities in the µM range. These results must be verified in the future and enhanced, to provide more detailed insights on the one hand of the molecular process of UV-induced conversion mechanism of the cellular form of the prion protein into its pathogenic isoform and on the other hand of the binding of inhibiting peptides as a basis for the development of a drug for prion diseases. In conclusion, it can be stated, that important new insights into the UV-induced conversion and aggregation mechanism of PrP obtained and also new and promising peptides were identified, which possibly can be optimized to effective folding inhibitors for the PrP.

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