Stammzell-basierte Neuroprotektion von retinalen Ganglienzellen in einem Mausmodell für das Glaukom

Abstract

Das Glaukom stellt eine heterogene Gruppe neurodegenerativer Netzhauterkrankungen dar, die durch eine apoptotische Degeneration der Ganglienzellen und ihrer Axone im optischen Nerven charakterisiert ist. Der progrediente Verlust der Ganglienzellen führt zu diskreten Gesichtsfeldausfällen und eventuell zur völligen Erblindung. Insbesondere vor dem Hintergrund der demographischen Alterung der Bevölkerung nimmt das Glaukom vor allem in den Industrieländern, in denen es bereits heute die zweithäufigste Ursache einer irreversiblen Blindheit darstellt, weiter an Bedeutung zu. Schätzungen zufolge werden bis 2020 etwa 80 Millionen Menschen weltweit an einem Glaukom erkrankt sein. Die klinisch derzeit einzige Therapiemöglichkeit des Glaukoms, besteht in einer Reduktion des intraokulären Drucks. Die Entwicklung effektiver alternativer Therapiemöglichkeiten ist daher von grosser klinischer Relevanz.

Neben Alter, genetischer Prädisposition, vaskulären Dysfunktionen, oxidativem Stress, erhöhtem Augeninnendruck und anderen Faktoren, zählt auch ein Mangel an neurotrophen Faktoren zu den Risikofaktoren, ein Glaukom zu entwickeln. Eine intraokuläre kontinuierliche Applikation von neurotrophen Faktoren gehört deshalb zu den präklinisch intensiv untersuchten Strategien, Therapien für glaukomatöse Erkrankungen aufzubauen. Ziel dieser Arbeit war es, in einem Mausmodell für das Glaukom das neuroprotektive Potenzial einer zellbasierten kontinuierlichen Applikation des neurotrophen Faktors „glial cell line-derived neurotrophic factor“ (GDNF) zu untersuchen.

In dieser Arbeit wurde bei adulten Mäusen der optische Nerv intraorbital lädiert, um eine schnelle apoptotische Degeneration der Ganglienzellen zu induzieren und so das Krankheitsbild des Glaukoms zu imitieren. Um zellbasiert den neurotrophen Faktor GDNF in die glaukomatösen Augen des Mausmodells einzuschleusen, wurden adhärent kultivierte neurale Stammzellen (NSZ) mit polycistronischen lentiviralen Vektoren transduziert. Um GDNF in den NSZ zu exprimieren (GDNF-NSZ), wurde ein Vektor benutzt, der unter Kontrolle des starken und ubiquitär aktiven „CMV enhancer/chicken ß-actin“ (CAG) Promoters für GDNF, ein fluoreszierendes Reporterprotein und ein Resistenzgen kodiert. NSZs für Kontrollexperimente (Kontroll-NSZ) wurden mit dem gleichen Vektor aber ohne die GDNF cDNA transduziert. Positive Zellen konnten so über „fluorescence-activated cell sorting“ (FACS) und über die Gabe von Antibiotika selektioniert werden. Untersuchungen der Zellen mittels Immunzytochemie und Western blots zeigten eine Expression von GDNF in den GDNF-NSZ Kulturen. In den Kontroll-NSZ Kulturen war dagegen keine Expression von GDNF nachweisbar. Einen Tag nach der Läsion des optischen Nerven, wurden die GDNF-NSZ oder die Kontroll-NSZ intravitreal transplantiert. Um den Effekt der transplantierten Zellen auf das Überleben der axotomierten Ganglienzellen zu untersuchen, wurden von den Netzhäuten 9 und 14 Tage nach der Läsion „flat-mount“ Präparate hergestellt, die Ganglienzellen mit anti-Brn3a Antikörpern angefärbt und die Zahl der Ganglienzellen bestimmt. Bei beiden Analysezeitpunkten konnten in den GDNF behandelten Netzhäuten 1,8 mal mehr überlebende Ganglienzellen nachgewiesen werden als in den Netzhäuten der Kontrolltiere. Eine statistische Analyse der Daten (einseitiger T-Test) ergab, dass der Unterschied in der Anzahl überlebender Ganglienzellen zu beiden Zeitpunkten statistisch signifikant war.

Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass über eine intravitreale Transplantation von genetisch modifizierten NSZ kontinuierlich eine funktionell relevante Menge des neurotrophen Faktors GDNF in glaukomatöse Netzhäute adulter Mäuse eingeschleust werden konnte, um eine läsionsinduzierte Degeneration retinaler Ganglienzellen signifikant zu verzögern. Das in dieser Arbeit eingesetzte intraokuläre, stammzellbasierte Applikationssystem eignet sich damit für präklinische Studien, die zum Ziel haben, zellbasierte neuroprotektive Therapieansätze für degenerative retinale Erkrankungen an geeigneten Mausmodellen zu evaluieren.