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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-76483
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7648/


Experimentelle und klinische Untersuchung zu antiviralen Effekten eines Spirulina Mikroalgen-Extrakts und dem daraus isolierten Polysaccharid Calcium Spirulan : eine mögliche neue prophylaktische Therapie bei Herpes labialis

Experimental and Clinical Evaluation of Antiviral Effects of Spirulina Platensis Microalgae Extract und the Sulfated Polysaccharide Calcium Spirulan : a possible new prophylactic Therapy against Herpes labialis

Mader, Julia

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SWD-Schlagwörter: Spirulina platensis
Freie Schlagwörter (Deutsch): Calcium Spirulan , HSV-1 , KSHV , Herpes labialis
Freie Schlagwörter (Englisch): Calcium Spirulan , HSV-1 , KSHV , Herpes labialis
Basisklassifikation: 42.32 , 44.43 , 35.99
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Brune, Wolfram (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 22.12.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Frühere Forschungsergebnisse mit einem Heißwasser-Extrakt aus S. platensis deuten auf eine antivirale Wirkung gegenüber Herpes Simplex Viren (HSV) sowie einigen anderen Herpesviren hin [183; 205]. Diese Daten wurden mit empfänglichen Zelllinien, allerdings nicht den natürlichen Wirtszellen, erhoben und sind methodisch kritisiert worden [185]. Aus diesen frühen Arbeiten ergab sich der Verdacht, dass das aus der Mikroalge S. platensis isolierte Polysaccharid Calcium Spirulan eine Hemmung früher Schritte der Virus-Zell-Interaktion bewirken und für die antivirale Wirkung verantwortlich sein könnte [184; 186].

In der hier vorgelegten Arbeit wurden zunächst antivirale Effekte eines definierten Extrakts aus S. platensis sowie hochgereinigtem Calcium Spirulan gegenüber Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1) in einer typischen empfänglichen Zelllinie mit verschiedenen Methoden zur Virusquantifizierung eindeutig belegt. Neben der Untersuchung zytopathologischer Effekte wurde eine quantitative PCR zur Analyse HSV-1 spezifischer DNA etabliert. Mit beiden Methoden konnte eine potente Inhibition der HSV-1-Infektion in Vero-Zellen durch Calcium Spirulan nachgewiesen werden. Der potente antivirale Effekt von Calcium Spirulan war vergleichbar mit der Wirkung von Aciclovir. Diese Experimente wurden mit einer humanen Keratinozytenzelllinie wiederholt, um die antiviralen Effekte an einer natürlichen HSV-1 Wirtszelle zu dokumentieren. Auch hier gelang es, eine eindeutige Hemmung von HSV-1 durch Calcium Spirulan sowie den S. platensis Mikroalgen-Extrakt nachzuweisen.

Des Weiteren wurde in verschiedenen experimentellen Ansätzen der antivirale Wirkmechanismus des S. platensis Extrakts sowie von Calcium Spirulan bei humanen Keratinozyten im Vergleich zu Modellsubstanzen wie Heparin (hemmt die Anheftung von HSV an die Wirtszelle) und Aciclovir (hemmt die virale DNA-Replikation) untersucht (‚time-of-addition’ und ‚adherence’ Experimente). Hieraus ergaben sich deutliche Hinweise für eine Inhibition des Eintritts von HSV in die Keratinozyten als Grundlage des antiviralen Effekts von Calcium Spirulan. Um diesen Mechanismus weiter experimentell zu belegen, wurde die Detektion des viralen Hüllproteins VP16 in Keratinozyten mittels Immunfluoreszenz und Durchflußzytometrie als Technik etabliert. Durch beide Verfahren konnte eindeutig gezeigt werden, dass Calcium Spirulan dosisabhängig den viralen Eintritt von HSV-1 in Keratinozyten hemmt.

Nachdem sich in der vorliegenden Arbeit in vitro eine Hemmung des Eintritts von HSV-1 in Keratinozyten durch Calcium Spirulan nachweisen ließ, wurde das mögliche therapeutische Potenzial dieser Beobachtung erstmals klinisch untersucht. Da HSV-1 der typische Auslöser
von Herpes labialis ist, wurde eine offene Studie bei Patientinnen durchgeführt die sich einer Farbtätowierung des Lippenrots, einem so genannten Permanent Make-up, unterzogen. Durch das Einbringen des Farbstoffs in den Rand des Lippenrots kommt es bei Individuen mit Herpes labialis regelmäßig zu einer Herpes-Reaktivierung. Damit war dieses klinische Modell besonders geeignet, um mögliche prophylaktische Effekte einer den Mikroalgenextrakt und Calcium Spirulan als aktive Substanzen enthaltenden topischen Formulierung im Vergleich zu einer konventionellen topischen und systemischen antiviralen Therapie zu untersuchen. In der klinischen Studie konnte bei 202 Probanden mit rezidivierendem Herpes labialis in der Vorgeschichte die sich dieser Maßnahme unterzogen ein protektiver Effekt der topischen Formulierung gegen eine Reaktivierung von Herpes labialis nachgewiesen werden. Die Wirkung der Calcium Spirulan und den S. platensis Mikroalgenextrakt enthaltenden Creme war hierbei den Effekten der topischen Anwendung von Aciclovir überlegen. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung der topischen Formulierung im Vergleich zur systemischen Aciclovir-Therapie eine Reduktion der Krustenbildung bei der Abheilung der Herpes-Reaktivierung bewirkte.

In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass die antiviralen Wirkungen von Calcium Spirulan nicht auf Effekte gegenüber HSV beschränkt sind. Es gelang erstmals, potente antivirale Effekte von Calcium Spirulan auf das Humane Herpes Virus Typ 8 (HHV-8) nachzuweisen, das als wichtiger viraler Auslöser einer malignen Entartung kutaner Endothelzellen und damit der Entwicklung eines Kaposi-Sarkoms angesehen wird (daher auch die Bezeichnung als Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus, KSHV). In Analogie zu den Befunden bei HSV, konnte mittels einer neu etablierten durchflußzytometrischen Analyse des KSHV/HHV-8-spezifischen Hüllproteins ORF45 gezeigt werden, dass auch diese antiviralen Effekte von Calcium Spirulan vor allem auf einer Hemmung des viralen Eintritts zu beruhen scheinen.

Die Resultate dieser Arbeit belegen, dass Calcium Spirulan ein potenter Inhibitor der HSV-1-Anheftung an humane Keratinozyten sowie der KSHV/HHV-8-Infektion in vitro ist. Die Ergebnisse der klinischen Untersuchung bestätigen die therapeutische Relevanz im Sinne einer prophylaktischen Wirkung von Calcium Spirulan bei Herpes labialis-Reaktivierungen.
Kurzfassung auf Englisch: Earlier studies indicated an antiviral activity of a hot-water extract from S. platensis against herpes simplex virus (HSV) and other herpesviruses [183; 205]. These data were critizised for their methods and the use of susceptible cell lines instead of herpes virus host cells [185]. These studies suppose Calcium spirulan, the isolated polysaccharide from S. platensis microalgae extract, to be the active compound and to inhibit early timepoints of virus-cell-interaction [184; 186].

First of all, the antiviral effects of a S. platensis microalgae extract and purified Calcium spirulan against herpes simplex virus type 1 (HSV-1) were analyzed in susceptible cells. The antiviral activity was detected by the determination of cytopathic effects and a quantitative PCR for HSV-1 specific DNA was established. The results showed a potent inhibition of HSV-1 infection by Calcium spirulan in Vero cells in both methods. This antiviral effect was comparable to the activity of acyclovir. These experiments were repeated in human keratinocytes, the primary target cells for HSV-1. The potent antiviral effect of Calcium spirulan and S. platensis microalgae extract was confirmed in keratinocytes.

Furthermore, the potential mechanism of HSV-1 inhibition by Calcium spirulan and the S. platensis microalgae extract was analyzed in comparison to the HSV-1 inhibitors heparin (blocks the virus attachment) and acyclovir (inhibits viral DNA replication). ‚Time-of-addition’ and ‚adsorption’assays showed strong evidence, that Calcium spirulan inhibits the entry of HSV-1 in keratinocytes. To analyze this mechanism, the detection of the viral tegument protein VP16 by immunofluorescence and flow cytometry analysis was established in human keratinocytes. The results showed that the dose-dependent inhibition of viral attachment is the underlying mechanism of Calcium spirulan. This effect was comparable to the activity of heparin.

Because of these findings in vitro, the therapeutic potential of Calcium spirulan was investigated in a clinical model for the first time. The prophylactic and therapeutic effect of a newly developed cream, containing Calcium spirulan and S. platensis microalgae extract, was evaluated in comparison to topical and systemical antiviral therapies, mainly acyclovir, in a clinical model of mechanical herpes reactivation by permanent make-up (PMU). Prophylactic and therapeutic effects for the topical formulation against herpes labialis reactivation in 202 patients were detected. The effectivity of the Calcium spirulan and S. platensis microalgae extract containing formulation was superior to that of topical acyclovir. The use of the topical formulation in comparison to systemical acyclovir showed a decrease in healing with a crust after herpes reactivation.

Furthermore, the spectrum of antiviral effects of Calcium spirulan to Kaposi’s Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) in vitro was extended. KSHV is the viral cause of Kaposi´s Sarcoma, a malignant tumor, and also known as human herpesvirus type 8 (HHV-8). Potential antiviral activity of Calcium spirulan against KSHV/HHV-8 infections could be detected. Finally, the potential mechanism of KSHV/HHV-8 inhibition by Calcium spirulan was analyzed. A flow cytometry analysis for the detection of the KSHV/HHV-8 specific tegument protein ORF45 was established and showed inhibition of viral entry by Calcium spirulan. This mechanism was similar to the inhibition of HSV-1 attachment to human keratinocytes by Calcium spirulan.

These results primarily revealed Calcium spirulan as a potent inhibitor of HSV-1 attachment to human keratinocytes and KSHV/HHV-8 infection in vitro. The successful use of a newly developed cream containing Calcium spirulan and S. platensis microalgae extract in a clinical model of HSV reactivation indicated a potential clinical relevance of these findings.

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