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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-76681
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7668/


Interaktion und strukturelle Aspekte humaner IgE-Antikörper im Kontext der Allergie

Interaction and structural aspects of human IgE-antibodies in context of allergy

Wolf, Sara Virginia

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SWD-Schlagwörter: Hypersensibilität , Allergologie , Allergie , Immunglobulin E , Immunglobuline , Antikörper , Insektengift
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Spillner, Edzard (Assoc. Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.12.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 23.12.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Allergien betreffen etwa ein Viertel aller Individuen in Industrienationen und die Prävalenz steigt stetig. Bis zu 9% der Bevölkerung reagieren auf Stiche von Insekten mit systemischen Reaktionen bis hin zum lebensbedrohlichen anaphylaktischen Schock. Besonders häufig unter den Allergieverursachenden Insekten sind Spezies der Hymenopteren vertreten, wie die Honigbiene Apis mellifera, die gemeine Wespe Vespula vulgaris und im südlichen Europa auch die Feldwespe Polistes dominula. Als einzige kurative Therapie von Allergien steht bislang ausschließlich eine spezifische Immuntherapie (SIT) zur Verfügung, welcher eine sorgfältige Diagnostik vorausgehen muss. Aufgrund von CCD- und proteinbasierten Kreuzreaktivitäten zwischen Giften verschiedener Spezies gestaltet sich dies besonders in der Hymenopterengiftallergie häufig als schwierig. Die Differenzierung zwischen Bienen- und Wespengiftallergie konnte durch die Verwendung von rekombinanten CCD-freiene Allergenen bereits erheblich verbessert werden. Da es sich bei gemeinen Wespen und Feldwespen um eng verwandte Spezies handelt, und sich Polistes dominula als invasive Spezies weiter von Mitteleuropa her ausbreitet, wird eine bislang kaum verfügbare differentielle Diagnostik auch hier dringend gebraucht.
Es wurden hierfür rekombinante Allergene aus dem Gift der Feldwespe Polistes dominulaund der gemeinen Wespe Vespula vulgarisin einem Prototypen des EUROLine Assays eingesetzt und die sIgE-Reaktivitäten von insgesamt 106 Patientenseren auf die Phospholipasen A1 Pol d 1 und Ves v 1, die Antigene 5 Pol d 5 und Ves v 5, die Serinprotease Pol d 4, sowie die Giftextrakte und einen CCD-Marker gemessen und analysiert. Durch diese Studie konnte gezeigt werden, dass in vielen Fällen durch molekulare Diagnostik die genuine Sensibilisierung auf eines der Gifte von einer kreuzreaktiven Reaktivität unterschieden werden kann. Die Ergebnisse illustrieren die Notwendigkeit der Verwendung aller rekombinanten CCD-freien Allergene in der in vitro Diagnostik.
Die TH2-getriebene Immunantwort gegen Parasiten und Allergene ist in der Regel mit einem erhöhten Serumtiter von hochaffinen antigenspezifischen IgE-Antikörpern verbunden. Die Fähigkeit auf kleinste Mengen Antigen mit der Auslösung von schweren anaphylaktischen Reaktionen zu reagieren, macht IgE zu einem mechanistisch herrausragenden Isotypen, der einzigartige Effektorfunktionen vermittelt. Trotz ihrer Relevanz für die Allergie, in der Immunüberwachung und bei der Bekämpfung von parasitären Infektionen ist über ihre Struktur sowiedie hochspezifische Interaktion mit ihren Antigenen noch vieles unbekannt.
Bislang war die geringe rekombinante Verfügbarkeit von humanen IgE-Antikörpern das Haupthemmnis in der strukturellen Charakterisierung dieses Isotyps. Hier wird u.a. die Expression von einem chimären leporid/humanen IgE mit Spezifität für CCDs vorgestellt. Unter Verwendung des Baculovirusexpressionssystem konnte in Sf9-Insektenzellen voll funktionaler IgE in Ausbeuten von über 30 mg/L erhalten werden. Die anschließende funktionelle Charakterisierung dieses Antikörpers zeigte die spezifische Interaktion mit verschiedenen Antigenen, dem hochaffinen FcεRI und spezifischen Antikörpern. Eine Analyse der Glykosylierung mittels Massenspektrometrie sowie unter Verwendung von Lektinen offenbarte hauptsächlich oligo- und teilweise fukosylierte paucimannosidische Glykane, welche typischerweise von Sf9-Zellen etabliert werden. Trotz der modifiizierten Glykosylierung konnte in einem Degranulationsassay keine Verringerung der biologischen Aktivität festgestellt werden.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung des monoklonalen CCD-spezifischen IgE zur Standardisierung des ELIFAB-Assays geeignet ist, welcher verwendet wird um den Erfolg einer SIT zu beurteilen.
Erstmals war durch die guten Ausbeuten auch die strukturelle Charakterisierung von einem intakten IgE-Antikörper möglich. Dies wurde in SAXS-Messungen und der Dateninterpretation mittels Modell-unabhängigen ab initio Methoden durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass der untersuchte IgE ein kompaktes Protein mit globulärer Struktur ist, welches kaum strukturelle Flexibilität aufweist. Dies sowie der erhaltene Molekülradius von etwa 53 Å legen nahe, dass humaner IgE in Lösung nicht in gestreckter, sondern in der sogenannten bent-Konformation vorliegt, wie bereits in kristallographischen Studien des IgE-Fc vermutet wurde.
Insgesamt werden die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse sowohl zum Verständnis des IgE-Netzwerks und von Allergien im Speziellen als auch zu der Verbesserung bestehender diagnostischer Testsysteme beitragen.
Kurzfassung auf Englisch: Allergies effect about a quarter of all individuals in industrial nations and the prevalence is continuously rising. Up to 9% of the population reacts to stings from insects with systemic reactions that go as far as to life threatening anaphylactic shocks. Species of the hymenoptera order such as the honey bee Apiss mellifera and theyellow jacket Vespula vulgaris as well as the paper wasp Polistes dominula in southern Europeare particularly frequent provokers of allergic reactions. The only available curative therapy for allergies so far is the specific immunotherapy (SIT), which requires thourough prior diagnostics. CCD- and protein-based cross reactivity between venoms from different species render diagnostic approaches in hymenoptera venom allergy in the majority of cases especially difficult. The differentiation between honey bee and yellow jacket venom allergy could already be highly improved by use of recombinant CCD-free allergens. For yellow jackets and paper wasps are closly related species and Polistes dominula is an invasive species that spreads from the Mediterranean area throughout northern Europe, now barly available differential diagnostics are much-needed here, as well.
For this approach recombinant allergens from the venom of the paper wasp Polistes dominula and the yellow jacket Vespula vulgaris were used in a prototype of the EUROLine assay and sIgE reactivities from 106 patient sera against the phospholipases Ves v 1 and Pol d 1, the antigens 5 Ves v 5 and Pol d 5, the serine protease Pol d 4 as well as venome extracts and a CCD marker were determined and analysed. This study could show that molecular diagnostics can in many cases distinguish genuine sensitization to only one of the hymenoptera venoms from cross reactivities. These findings illustrate the necessity of the application of all available recombinant CCD-free allergens in in vitro diagnostics.
The TH2-biased immune response against parasites and allergends is usually linked to elevated antigen specific high affinity IgE titers in patients’ sera. The ability to react to minute amounts of antigen and thereby provoking severe anaphylactic reactions renders IgE mechanistically an outstanding isotype that mediates unique effector functions. Despite its relevancein allergy, immune surveillance and immune response to parasitic infections structural knowledge about human IgE and the antibodies interaction with antigens is scarce. To date the limited recombinant availability of human IgE antibodies precluded the structural charaterisation of this isotype. Here among others the expression of a chimeric leporid/human IgE with specificity for CCDs was presented. Using the baculovirus expression system fully functional IgE could be obtained from Sf9 insectcells in yields of more than 30 mg/L. Subsequent functional charaterisation of this antibody proved specific interaction with different antigens, the high affinity FcεRI as well as specific antibodies. The analysis of the glycosylation via mass spectrometry and application of lectins in ELISA revealed predominantly oligo- and partialy fucosylated paucimannosidic glycans, which are typically established by Sf9 insect cells. Despite the altered glycosylation in a degranulation assay no reduction in biologic activity could be observed. Furthermore it could be demonstrated that use of the monoclonal CCD-specific IgE is suitable for standardization of the ELIFAB assay, which is used to assess the success of a SIT treatment.
For the first time the high yields allowed for the structural characterization of an intact IgE antibody. This was achieved by SAXS measurements and subsequent model independent ab initio interpretation of the obtained data. It was shown that the analysed IgE is a compact protein with a globular structure, which showed little structural flexibility. This as well as the obtained radius of gyration of approximately 53 Å indicate that human IgE adopts a bent conformation in solution like already indicated by X-ray crystallographic analyses of the IgE-Fc part.
Altogehter the results obtained from this work will contribute to the understanding of the IgE network an allergies in particular as well as to the improvement of established diagnostic assays.

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