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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65666
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/6566/


Generation of tissue-specific vectors by in vivo selection of random peptide libraries displayed on the surface of adeno-associated virus type 2

Herstellung gewebsspezifischer Vektoren durch in vivo Selektion von randomisierten adeno-assoziiert viralen Peptidbanken

Körbelin, Jakob

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Freie Schlagwörter (Deutsch): AAV-Peptidbank , in vivo Selektion , Gentherapie
Freie Schlagwörter (Englisch): random AAV display peptide library , in vivo selection , gene therapy
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Trepel, Martin (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 25.05.2016
Kurzfassung auf Englisch: After an initial period of enthusiasm, it was realized that major obstacles have to be overcome before the young discipline of gene therapy would fulfill its high expectations. The lack of highly efficient and target-specific vector systems with a superior safety profile was soon identified as the biggest hurdle. Recombinant vectors based on adeno-associated virus (AAV) have emerged as promising candidates to solve this problem. Peptide libraries displayed on the surface of the AAV capsid have been developed to generate viral particles with new tropism, thereby broadening the spectrum of potential host cells and increasing specificity.
This study aimed at identifying AAV variants that allow efficient and specific transduction of target tissues after systemic application by screening random AAV display peptide libraries in vivo and characterizing selected AAV variants. Choosing brain and lung as therapeutically highly relevant targets, the results of two methodically slightly different in vivo screenings in a mouse model were analyzed, one of which was performed as part of this study. The most promising library clones NRGTEWD (brain) and ESGHGYF (lung) were used to generate luciferase reporter gene vectors which for the first time enabled highly efficient transgene expression specifically in the organs of interest. The specific transgene expression was proven to be caused by specific vector homing on DNA level. Efficiency and specificity of transgene expression mediated by the brain-enriched peptide NRGTEWD could be further enhanced by utilization of the CAG promoter instead of the CMV promoter. Long-term analyses revealed durability of transgene expression mediated by the lung-selected clone ESGHYGF and the absence of immune-related vector silencing, proving the general applicability for therapeutic approaches. Both vectors (NRGTEWD and ESGHGYF) were shown to transduce the vascular endothelium of their respective target organs with high efficiency, thereby providing a promising tool for future gene therapy interventions in this clinically highly relevant tissue. Alanine scanning mutagenesis of the enriched peptides was performed to gain more information about their structural functionality and revealed the potential negative influence of a single amino acid (E) within the peptide ESGHGYF, thereby giving room for futher optimizations, whereas every single amino acid seemed to be functionally important in case of the peptide NRGTEWD.
The results of this study do not only indicate the existence of a common cell surface molecule in the endothelial cells of the microvasculature of the central nervous system (CNS) and the lung which allow to differentiate these cells from the rest of the endothelium, they also prove the general applicability of random AAV display peptide libraries in vivo by providing potential gene therapy vectors for the CNS and the pulmonary microvasculature, some of which are already under development. Thus, this study is likely to have broad implications on applied vectorology as well as on basic biomedical research.
Kurzfassung auf Deutsch: Eines der größten Probleme im noch jungen Feld der Gentherapie stellt das Fehlen zielgerichteter Vektorsysteme dar, die den enormen Sicherheitsansprüchen genügen. Rekombinante Vektoren auf Basis des Adeno-assoziierten Virus (AAV) entwickleten sich im Laufe des letzten Jahrzehnts zu äußerst vielversprechenden Kandidaten zur Lösung dieses Problems. Um den unspezifischen Tropismus von AAV umzulenken, sind auf dem AAV-Kapsid präsentierte randomsierte Peptidbanken entwickelt worden, welche aus einer enorm großen Anzahl viraler Partikel mit unterschiedlichsten Eigenschaften bestehen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung von Kapsidvarianten aus randomisierten AAV-Peptidbanken, die nach systemischer Applikation in vivo einen effizienten und zielgerichteten Gentransfer in vordefiniertes Gewebe erlauben. Dafür wurden die Ergebnisse zweier methodisch geringfügig verschiedener in vivo Selektionen im Mausmodell in zwei therapeutisch relevanten Organen (Gehirn und Lunge) analysiert, von denen eine Selektion im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführt wurde. Die vielversprechendsten Klone mit den Peptiden NRGTEWD (selektiert für Gehirntropismus) und ESGHGYF (selektiert für Lungentropismus) wurden als Reportergen-vektoren (Luciferase) getestet und erlaubten erstmalig zielgerichtete Genexpression nach systemischer Applikation mit bisher unerreichter Spezifität. Mittels quantitativer PCR konnte verifiziert werden, dass die vektorvermittelte Genexpression tatsächlich auf organspezifischer Transduktion beruht. Die Effizienz der Transgenexpression im Zielgewebe konnte im Falle des Hirn-gerichteten Klons NRGTEWD durch den Einsatz des CAG-Promoters weiter erhöht werden. Getestet für den Lungen-gerichteten Klon ESGHGYF, zeigte die Analyse der Genexpression im Langzeitversuch eine sehr hohe Stabilität was auf das Ausbleiben eines immunassoziierten Vektor-Silencings schließen lässt und damit die potentielle Anwendbarkeit dieses Klons für therapeutische Zwecke bestätigt. Mittels immunhistologischer Untersuchungen wurde gezeigt, dass beide getesteten Vektoren extrem effizient das Endothel ihrer Zielorgane transduzieren, was sie zu äußerst interessanten Kandidaten für zukünftige gentherapeutische Interventionen in diesem klinisch hochgradig relevanten Gewebe macht. Weitere Informationen über Funktionalität der selektierten Peptide konnten mittels Alanin-Scan Mutagenese gewonnen werden. Hierbei zeigte sich im Falle von ESGHGYF ein potentiell negativer Einfluss einer einzelnen Aminosäure (E), was Raum für zukünftige Peptid-Optimierungen lässt, während im Falle des Peptids NRGTEWD jede einzelne Aminosäure funktionell wichtig zu sein scheint. Die Ergebnisse dieser Arbeit implizieren die Existenz eines gemeinsamen Zelloberflächenmoleküls auf Endothelzellen der Mikrovaskulatur des zentralen Nervensystems (ZNS) und der Lunge, welches diese vom Rest des Endothels abgrenzt. Damit bereitet der in dieser Arbeit beschriebene erfolgreiche in vivo- Einsatz von AAV-Peptidbibliotheken die Grundlage für zukünftige Gentherapievektoren des ZNS und der Lunge, von denen sich einige bereits in Entwicklung für präklinische Untersuchungen befinden.

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