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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-66583
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/6658/


Chemo-enzymatische Strategien zur Markierung eukaryotischer mRNA

Chemo-enzymatic strategies for labeling eukaryotic mRNA

Schulz, Daniela

pdf-Format:
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Freie Schlagwörter (Deutsch): Click Reaktion , Methyltransferase , AdoMet-Analoga , mRNA
Freie Schlagwörter (Englisch): click reaction , methyltransferase , AdoMet-analogue , mRNA
Basisklassifikation: 35.75 , 35.73
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Rentmeister, Andrea (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 28.04.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Eine subzelluläre Lokalisation spezifischer mRNAs konnte in verschiedenen Zellen und Organismen, wie Hefen, Oozyten und Neuronen nachgewiesen werden. Die asymmetrische Verteilung dieser Biomoleküle ermöglicht eine zeitlich und räumlich kontrollierbare Initiation der Translation und stellt einen weiteren Mechanismus zur Regulierung der Genexpression dar. Die Charakterisierung von Transportprozessen, Dynamiken und möglichen Fehlregulierungen subzellulär lokalisierter mRNAs könnte neue Einblicke in Entwicklungsprozesse sowie Ursachen von Krankheiten bieten und neue Therapiemöglichkeiten, beispielsweise im Bereich neuronaler Erkrankungen, eröffnen. Die Markierung und Analyse des Biomoleküls mRNA in lebenden Zellen ist daher von enormer Wichtigkeit und eine optimale Methode hierfür sollte (i) endogene RNA markieren, (ii) keine Hintergrundfluoreszenz durch ungebundene Sonden aufweisen und (iii) eine hohe Spezifität sowie (iv) die Kompatibilität mit dem lebenden System gewährleisten. Im Gegensatz zu derzeit etablierten Methoden könnten chemo-enzymatische Strategien alle diese Kriterien erfüllen und eine neue Möglichkeit zur Visualisierung von mRNA darstellen.
In dieser Arbeit wurde daher ein chemo-enzymatischer Ansatz zur Markierung eukaryotischer mRNA entwickelt. Hierdurch wurde eine Grundlage für die Etablierung neuer möglicher Methoden zur mRNA-Analyse geschaffen.
Um die notwendige spezifische Markierung eukaryotischer mRNA zu erreichen, wurden zunächst die Kappen-modifizierenden Trimethylguanosinsynthasen hTgs1 und GlaTgs2, welche die Hypermethylierung der mRNA-Kappe an Position N2 katalysieren, hinsichtlich promiskuitiver Aktivität gegenüber AdoMet-Analoga getestet. Die Enzyme wurden rekombinant hergestellt und in Biokonversionen mit dem natürlichen Cosubstrat AdoMet sowie dem AdoMet-Analogon AdoPropen eingesetzt. Für GlaTgs2 konnte eine geringe promiskuitive Aktivität gegenüber dem Analogon nachgewiesen werden. Um diese zu verbessern, wurden Aminosäuren, deren Seitenketten den Zugang der voluminöseren AdoMet-Analoga zum katalytischen Zentrum behindern könnten, identifiziert und durch Alanin substituiert. Eine der erhaltenen Varianten zeigte im Vergleich zum Wildtyp-Enzym eine deutlich verbesserte Substrataffinität und verbesserte katalytische Produktivität gegenüber AdoPropen sowie eine bessere katalytische Produktivität mit AdoEnYn.
Durch die Enzym-Variante konnte eine effiziente Modifizierung der Kappe durch Transfer eines Alkenyl- bzw. Alkinylrest erreicht werden, wodurch mRNAs für spezifische Markierungen durch verschiedene Click-Reaktionen zugänglich wurden.
Das alkenylierten Kappen-Analogon N2-Allyl-m7GpppA konnte erfolgreich in einer Thiol-En-Click-Reaktion mit einem Thiol-haltigen Biotin-Analogon kovalent verknüpft werden. Darüber hinaus konnte eine Fluoreszenzmarkierung der alkenylierten Kappe N2-Allyl- m7GpppA durch verschiedene Photoclick-Reaktionen erreicht werden. Die enzymatische Alkinylierung der mRNA-Kappe und anschließende chemische Modifizierung durch die Cu(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) ermöglichte nicht nur eine spezifische Fluoreszenzmarkierung des Substrats m7GpppA sondern auch einer >100 nt Kappen-tragenden RNA.
Durch die Modularität des etablierten Ansatzes war es möglich, verschiedene reaktive Gruppen auf die eukaryotische mRNA-Kappe zu übertragen und verschiedene Click-Reaktionen und Reportermoleküle zur spezifischen Markierung zu nutzen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Flexibilität des chemo-enzymatischen Ansatzes und die Möglichkeit, durch eine Erweiterung der etablierten Protokolle, neue, vielversprechende Strategien nicht nur zur Visualisierung von mRNA in lebenden Zellen, sondern auch zur Isolierung von mRNA aus komplexen Proben zu erhalten.
Kurzfassung auf Englisch: Subcellular localization of mRNAs has been found in different cells and organisms like yeast, oocytes and neurons. The asymmetric distribution of these biomolecules enables temporally and spatially controlled initiation of translation and provides a further mechanism for regulating gene expression.
Characterizing transport, dynamics and misregulation of subcellularly localized mRNAs could allow insights into development processes as well as causes of disease and possibly open up new possibilities for therapies, e. g. in the field of neuronal diseases. Thus, labeling and analysis of the biomolecule mRNA in living cells is of tremendous interest. An ideal method for this aim should (i) allow detection of endogenous RNA, (ii) prevent background fluorescence of unbound probes, (iii) exhibit high specificity and (iv) be compatible with the living system. In contrast to currently established methods, chemo-enzymatic strategies could fulfill all of these criteria and constitute a novel possibility to visualize mRNA.
Therefore a chemo-enzymatic strategy for labeling eukaryotic mRNAs was developed in this work, providing a basis for the establishment of novel methods for mRNA-analysis.
To achieve specific labeling of eukaryotic mRNAs in the first step, the cap-modifying trimethylguanosinsynthases hTgs1 and GlaTgs2, known to hypermethylate the eukaryotic mRNA-cap at position N2, were characterized regarding promiscuous activity on AdoMet-analogs. The enzymes were recombinantly produced, purified and used in bioconversions with the natural cosubstrate AdoMet as well as the AdoMet-analog AdoPropen and low promiscous activity of GlaTgs2 on the analog was revealed. To improve this side-activity, amino acids, which potentially inhibited access of analogs to the catalytic center, were identified and substituted by alanine. One of the generated GlaTgs2-variants showed improved substrate affinity and turnover number on AdoPropen compared to the wildtype-enzyme as well as an improved turnover number with AdoEnYn.
Using this variant, efficient modification of the cap by transferring alkene or alkyne residues was achieved, making mRNAs accessible for labeling by different click reactions.
The alkenylated cap-analog N2-Allyl-m7GpppA could be linked covalently to a thiol-containing biotin-analog in a thiol-ene click reaction. Furthermore, fluorescent labeling of the allylated cap-analog was achieved by photoclick reactions.
Enzymatic alkynylation and chemical modification by Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) enabled specific fluorescent labeling not only of the minimal capped RNA m7GpppA but also of a >100 nt long cap-bearing RNA.
Owing to the modularity of the established strategy it was possible to enzymatically transfer different reactive groups to the eukaryotic mRNA-cap, making it accessible for specific modification with different reporter molecules in different click reactions. These results emphasize the flexibility of the chemo-enzymatic approach and demonstrate, that an expansion of the established protocols could provide a promising basis for the development of novel methods for visualization of mRNAs in living cells but also for isolation of mRNAs from complex samples.

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