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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-67274
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/6727/


A photoactivated adenylyl cyclase as an optogenetic tool to manipulate neuronal signaling and synaptic plasticity

Eine photoaktivierte Adenylatzyklase als optogenetisches Werkzeug zur Manipulation neuronaler Signalwege und synaptischer Plastizität

Udwari, Daniel

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SWD-Schlagwörter: Cyclo-AMP , Synapse , Optogenetik , Sekundärer Bote , Hippocampus , Langzeitpotenzierung , Nervenzelle
Freie Schlagwörter (Deutsch): cAMP , Adenylatzyklase
Freie Schlagwörter (Englisch): cAMP , optogenetics , second messenger , synaptic plasticity , LTP
Basisklassifikation: 42.03 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Oertner, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.03.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 27.04.2016
Kurzfassung auf Englisch: To improve our understanding of brain function, temporally and spatially precise manipulation of neurons and neuronal circuits is needed. This is limited with standard methods based on pharmacological manipulations and electrophysiology. In recent years, novel optogenetic tools have become available which promise to facilitate more precise spatiotemporal control of neuronal activity and signaling. In this thesis, I introduce bPAC (Beggiatoa photoactivated adenylyl cyclase), a member of a new class of optogenetic actuators which I characterized in hippocampal neurons. bPAC is a soluble adenylyl cyclase, which produces cAMP upon illumination with blue light. It allows for manipulation of intracellular cyclic AMP signaling, a ubiquitous second messenger system important for neuronal plasticity, learning and memory. bPAC is small compared to similar optogenetic tools (350 amino acids) and very light sensitive, which are desirable attributes in an optogenetic actuator, commending it for in vivo and in vitro applications. I expressed bPAC in hippocampal organotypic slice cultures using different gene delivery techniques which allow for sparse or regionally limited expression. Neurons express bPAC well and I could reliably use bPAC to elevate intracellular cAMP levels in a controlled manner to concentration ranges similar to what can be achieved with canonical pharmacological tools. Optogenetic cAMP elevation activated conductances underlying slow inward current in these neurons, which was in large part due to cAMP modulation of hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated (HCN) channels. Under elevated cAMP concentrations, miniature EPSC frequency, but not amplitude, increased reversibly in CA1 cells. These effects were acute and not lasting. To study the effects of postsynaptic cAMP signaling on neuronal plasticity, I used two approaches: 1) intracellular recordings in postsynaptic neurons with presynaptic channelrhodopsin stimulation, and 2) paired recordings of unitary synaptic connections between two hippocampal pyramidal cells. I show that elevation of postsynaptic cAMP alone is not sufficient to induce synaptic potentiation, nor to modulate plasticity induction in a theta burst protocol.
Taken together, cAMP is a viable tool to elevate neuronal cAMP levels and to study intracellular second messenger signaling with unprecedented temporal and spatial precision.
Kurzfassung auf Deutsch: Methoden zur räumlich und zeitlich präzisen Manipulation von Nervenzellen sind wichtig, um unser Verständnis des Gehirns und seiner Funktionsweise voranzutreiben. Mit den pharmakologischen und elektrophysiologischen Standardmethoden ist dies nur eingeschränkt möglich. In den letzten Jahren stehen zunehmend neuartige optogenetische Werkzeuge zur Verfügung, welche eine größere räumlich-zeitliche Kontrolle über neuronale Aktivität und Signalwege versprechen. In dieser Arbeit stelle ich bPAC (Beggiatoa photoaktivierte Adenylatzyklase) vor, Teil einer neuen Klasse von optogenetischen Effektoren, und charakterisiere bPAC in hippocampalen Neuronen. bPAC ist eine lösliche Adenylatzyklase, die bei Beleuchtung mit blauem Licht zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) herstellt. Die Lichtabhängigkeit erlaubt eine nicht-invasive Manipulation von intrazellulären cAMP-abhängigen Signalkaskaden, einem ubiquitären Second-Messenger-System, welches unter anderem für neuronale Plastizität, Lernen und Gedächtnis wichtig ist. bPAC ist klein im Vergleich zu ähnlichen optogentischen Effektoren (350 Aminosäuren) und sehr lichtempfindlich, zwei wertvolle Attribute in einem optogenetischen Werkzeug, wodurch bPAC für in vivo und in vitro Anwendungen geeignet ist. Ich benutzte verschiedenen Transfektionstechniken, um bPAC in organotypischen Kulturen in einzelnen Neuronen oder in spezifischen Regionen des Hippocampus zu exprimieren. Ich konnte zeigen, dass mittels bPAC die intrazelluläre cAMP-Konzentration in einer kontrollierten und reproduzierbaren Art und Weise erhöht werden kann. Dabei können ähnliche cAMP-Konzentrationen wie mit klassischen pharmakologischen Methoden erreicht werden. Optogenetische Erhöhung der cAMP-Konzentration führt zu einer Öffnung von Membrankanälen und zu einem langsamen Einwärtsstrom, welcher zu einem großen Teil durch cAMP-abhängige Modulation von hyperpolarisationsaktivierten zyklonukleotid-gesteuerten Kanälen (HCN) verursacht wird. Während der lichtinduzierten erhöhten cAMP-Konzentration in CA1 Neuronen steigt die Frequenz, jedoch nicht die Amplitude von Miniatur-EPSCs reversibel an. Diese Effekte sind akut und reversibel. Um die Auswirkungen der postsynaptischen cAMP-Signalkaskaden auf neuronale Plastizität zu untersuchen, verfolgen wir zwei Ansätze: 1) Intrazelluläre Messungen, kombiniert mit Channelrhodopsin-Stimulation, und 2) Messung der synaptischen Verbindung zwischen zwei hippocampalen Pyramidenzellen(paired-patch Experimente). Ich konnte zeigen, dass die Erhöhung von postsynaptischem cAMP nicht ausreicht, um eine synaptische Potenzierung zu induzieren. Die Induktion synaptischer Plastizität durch Theta-Burst Stimulation war durch postsynaptische cAMP Erhöhung ebenfalls nicht verändert. Zusammenfassend lässt sich sagen, das bPAC ein neues und äußerst potentes Werkzeug ist, um die cAMP-Konzentration in individuellen Nervenzellen kontrolliert zu erhöhen und dadurch intrazelluläre Signalwege mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision zu untersuchen.

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