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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-68027
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/6802/


Sequenzspezifische RNA-Detektion basierend auf dem RNA-bindenden Protein Pumilio

Sequence-specific RNA-detection using the RNA-binding protein Pumilio

Rath, Anna Katharina

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SWD-Schlagwörter: RNS , Bildgebendes Verfahren , Nachweis , Grün fluoreszierendes Protein , Ribonucleoproteine , Komplementierung
Freie Schlagwörter (Deutsch): Fluoreszenzkomplementierung , Pumilio
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Rentmeister, Andrea (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 27.04.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Die Visualisierung von RNAs in lebenden Zellen ist sehr bedeutend für die Untersuchung der subzellulären Lokalisation, der Strukturveränderungen sowie der Prozessierung von RNA. Insbesondere die Verfolgung der Dynamiken und Transportprozesse subzellulär lokalisierter mRNAs, könnte dazu beitragen, die Rolle dieser mRNAs bei der Entstehung neuronaler Fehlregulationen oder Krebs besser zu verstehen. Die Entwicklung genetisch kodierbarer Sonden zur Detektion endogener RNA ist von großer Bedeutung, da die natürlichen Prozesse in der Zelle nicht durch das Einbringen der Sonden von außen gestört werden.
Für die Entwicklung einer vollständig proteinbasierten Sonde zur sequenzspezifischen Detektion von RNA, wurde im Rahmen dieser Arbeit das RNA-bindende Protein Pumilio rekombinant produziert, gereinigt und charakterisiert. Die RNA-Detektionsmethode der tetramolekularen Fluoreszenzkomplementierung (TetFC), die auf Pumilio und einem dreiteiligen split-GFP beruht, wurde bezüglich einer in vivo Anwendung charakterisiert. Dabei wurde eine negative Temperaturabhängigkeit und eine Nachweisgrenze von 16 nM in Anwesenheit kompetierender RNA bestimmt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TetFC in vivo realisierbar ist. Des Weiteren wurde mit der TetFC die Ausbildung einer Stamm-Schleife-Struktur mit einem 5-fachen Signalanstieg nachgewiesen. Darüber hinaus wurde der Unterschied in der Struktur zweier RNAs aufgezeigt, welche sich in ihrer Sequenz lediglich durch zwei Nukleotide unterscheiden. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für zukünftige intrazelluläre RNA-Strukturanalysen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Anzahl möglicher RNA-Targets der TetFC durch die Entwicklung der Ribonukleoprotein-Fluoreszenzkomplementierung erweitert. Die Verwendung kurzer einzelsträngiger Staple-RNAs, sowie einer neuen Pumilio-Variante stimulierte dabei erfolgreich die Fluoreszenzkomplementierung an Target-RNA, die nur ein oder gar kein Pumilio-Bindemotiv enthielt. Mit einem 25-fachen Signalanstieg konnte beir Verwendung einer Staple-RNA die L1 mRNA in vitro detektiert werden. Mit Hilfe zweier Staple-RNAs konnten gespleißte und ungespleißte HIV-RNAs unabhängig von der Sequenzspezifität des Pumilio-Proteins in vitro unterschieden werden.
Die Etablierung einer neuen Screening-Strategie für Pumilio-Varianten mit veränderten Bindungseigenschaften war nicht erfolgreich, da die (in der Literatur beschriebene) RNA-Abhängigkeit der Interaktion des Pumilios mit dem Protein Nanos nicht bestätigt wurde.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Rahmen dieser Arbeit die Grundlagen zur Pumilio-basierten sequenzspezifischen Detektion endogener RNA in vivo mittels TetFC und RNP-FC gelegt wurden. Diese Methoden sollten es ermöglichen, nicht nur die subzelluläre Lokalisation endogener RNA zu verfolgen sondern auch maßgeschneiderte RNPs aufzubauen.
Kurzfassung auf Englisch: RNA imaging in living cells is important for analysis of subcellular localization, structural changes as well as processing of RNAs. Especially, visualization of dynamics and transport processes of subcellularly localized RNAs may help us understand their role in neuronal diseases and cancer. Development of genetically encoded probes is especially important to keep natural conditions within the cell.

In order to develop a completely protein-based sequence-specific RNA probe, the RNA-binding protein Pumilio was produced, purified and characterized. The tetramolecular fluorescence complementation (TetFC), an RNA detection method based on Pumilio and a tripartite split-GFP, was characterized for future applications in vivo. A negative temperature dependency as well as a detection limit of 16 nM RNA in presence of competitive RNA was determined. The results of this study in combination with the possibility to produce all components by the cellular machinery suggest that TetFC may become realized in vivo.
Furthermore, TetFC could be used to detect formation of a stem-loop-structure within RNA with a 5-fold signal enhancement. A structural difference of two RNAs that differ only in two nucleotides was also demonstrated. These results are the basis for future analyses of RNA-secondary structures in cells.

The number of RNA targets accessible by TetFC was increased by developing ribonucleoprotein-fluorescence complementation (RNP-FC). Application of short single stranded staple RNAs in combination with a new Pumilio variant stimulated efficiently self-organized formation of an RNP-complex on target RNA containing only one or even no Pumilio binding motif. With the use of one staple RNA the L1 RNA could be detected in vitro with a 25-fold increased signal compared to non-target RNA. Using combinations of two staple RNAs, spliced and unspliced HIV-RNAs could be discriminated yielding a detection system independent on Pumilio’s inherent sequence specificity. Development of a new in vitro screening system for Pumilio proteins was not successful, since the previously described RNA-dependency of the interaction of Pumilio with the protein Nanos could not be confirmed.

In summary, this thesis provides first results for future Pumilio-based sequence-specific RNA detection in vivo via TetFC and RNP-FC. These systems should not only allow imaging of subcellular localization of endogenous RNA but also to build up tailor-made artificial RNPs.

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