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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-68690
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/6869/


Untersuchungen zur Rolle von Arc/Arg3.1 in synaptischer Plastizität und endosomaler Sortierung

Investigation of the role of Arc/Arg3.1 in synaptic plasticity and endosomal sorting

Binkle, Lars

pdf-Format:
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Basisklassifikation: 44.90
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kuhl, Dietmar (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.06.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 29.04.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Die Konsolidierung des Gedächtnisses hin zu einer langanhaltenden Form, ist von der Induktion Aktivitäts-regulierter Gene und deren Einfluss auf neuronale Verbindungen abhängig. Eines dieser Gene ist das immediate early gene Arc/Arg3.1, dessen mRNA und Protein in Abhängigkeit Plastizitäts-induzierender Stimuli in die Dendriten der aktivierten Neurone transportiert wird. Mäuse mit einer genetischen Deletion von Arc/Arg3.1 zeigen schwere Störungen in der Konsolidierung der synaptischer Plastizität und des Langzeitgedächtnisses, während die grundlegende synaptische Transmission und das Kurzzeitgedächtnis intakt sind. Arc/Arg3.1 interagiert mit Komponenten der Clathrin-abhängigen Endozytose-Maschinerie und beeinflusst die Oberflächenexpression von ionotropen Glutamat-Rezeptoren vom Typ AMPA (α-amino-5-hydroxy-3-methyl-4-isoxazole propionic acid). Die Änderung der Komposition und Menge an synaptischen AMPA-Rezeptoren wird als zentraler Mechanismus der synaptischen Plastizität angesehen. Der Einfluss von Arc/Arg3.1 auf diesen Mechanismus und die zu Grunde liegenden molekularen Wechselwirkungen sind weitgehend unverstanden. Neben einer Verbindung zur Endozytose weist die Interaktion von Arc/Arg3.1 mit der γ-Secretase auf eine Funktion in der endosomalen Sortierung von Membranproteinen hin. Die Prozessierung der Membranproteine APP (Amyloid Precurser Protein) und Notch1 durch die γ-Secretase wird entscheidend durch die Aktivitäts-regulierte Expression von Arc/Arg3.1 verändert. Es ist jedoch unklar wie Arc/Arg3.1 die endosomale Sortierung der γ-Secretase und möglicherweise auch von AMPA-Rezeptoren beeinflussen kann.
Zur Beantwortung dieser Frage und zum besseren Verständnis der molekularen Funktion von Arc/Arg3.1 haben wir im Hefe-Zwei-Hybrid-System nach neuen Arc/Arg3.1-Bindungspartnern gesucht. Mehrere der neu identifizierten Bindungspartner sind mit dem endosomalen System der Zelle assoziiert. In dieser Arbeit habe ich drei der Proteine auf deren Kolokalisation und Bindungseigenschaften mit Arc/Arg3.1 hin untersucht. Sorting Nexin-7 (SNX7), ein noch nicht charakterisiertes Mitglied der Sorting-Nexin-Familie hat sich als robuster Bindungspartner von Arc/Arg3.1 erwiesen. Sorting Nexine sind durch ihre Phosphatidyl-Inositolphosphat-bindende PX-Domäne charakterisiert, welche eine Bindung an spezifische Membrankompartimente vermittelt. SNX7 besitzt zudem eine BAR-(Bin-Amphiphysin-Rvs)-Domäne und zählt daher zu der Subfamilie der SNX-BAR-Proteine. SNX-BAR-Proteine sind ein zentraler Bestandteil der endosomalen, tubulären Sortierung-Maschinerie für Membranproteine. Durch die in silico Modellierung der SNX7-BAR-Domäne und der Analyse von Substitutionsmutanten war es mir möglich, die Bindungsstelle von Arc/Arg3.1 innerhalb eines von Leucinen dominierten, hydrophoben Bereiches der SNX7-BAR-Domäne zu identifizieren. Die untersuchten Substitutionsmutanten beeinträchtigen nicht die Formierung des SNX7/4-Heterodimer, an welches auch Arc/Arg3.1 bindet und welches als die funktionelle Einheit in der endosomalen, tubulären Sortierung betrachtet wird. Alle drei Proteine kolokalisieren an Frühen Endosomen und in dendritischen Spines von Neuronen. Die Verteilung der Proteine in Spines weist auf eine Subpopulation von Arc/Arg3.1 hin, welche auch dort mit SNX7/4-positiven Endosomen assoziiert ist. Darüber hinaus zeigen meine Analysen, dass SNX7 mit CPG2 (candidate plasticity gene 2) assoziiert ist, welches Teil der Endozytischen Zone in Spines und bedeutend für die Endozytose von AMPA-Rezeptoren ist. SNX7 und Arc/Arg3.1 zeigen beide eine Assoziation mit der Clathrin-abhängigen Endozytose-Maschinerie und verstärken die Internalisierung von Transferrin. Ein weiterer neu identifizierter Bindungspartner von Arc/Arg3.1 ist AMPH2 (Amphiphysin-2), welches ebenfalls Bestandteil der Endozytose-Maschinerie ist. Der kooperative Effekt von AMPH2 auf die Arc/Arg3.1-vermittelte Erhöhung der Internalisierung von Transferrin, zeigt eine funktionelle Verbindung beider Proteine in der Clathrin-abhängigen Endozytose. Meine Untersuchungen der SNX7-Expression im Mausgehirn und die Generierung von KO-Mäusen zeigen zudem, dass SNX7 insbesondere in Arealen, welche mit Lern- und Gedächtnisprozessen in Verbindung gebracht werde, exprimiert wird.
Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigen zum ersten Mal eine direkte Verbindung von Arc/Arg3.1 mit der endosomalen Sortierung von Membranproteinen. Die Assoziation von Arc/Arg3.1 und SNX7 mit der Endozytose-Maschinerie und Endosomen in Spines weist zudem auf eine Kopplung beider Prozesse hin und eröffnet neue Erklärungsansätze für die vielseitige Wirkung von Arc/Arg3.1 in synaptische Plastizität
Kurzfassung auf Englisch: Consolidation of long-term memories requires activity-dependent gene induction that is important in defining neuronal connectivity in the brain. One of these genes is the immediate early gene Arc/Arg3.1 whose mRNA and protein are rapidly distributed throughout the dendritic arbor of activated neurons. Arc/Arg3.1 KO mice show severe impairments in memory consolidation and synaptic plasticity, while basic synaptic transmission and short-term memory are unaffected. Arc/Arg3.1 binds to proteins involved in clathrin-dependent endocytosis and affects surface expression of AMPA (α-amino-5-hydroxy-3-methyl-4-isoxazole propionic acid) receptors. Changes in synaptic AMPA receptor composition and number are believed to be the basic mechanism of synaptic plasticity. How Arc/Arg3.1 controls this mechanism and the underlying molecular interactions are largely unknown. In addition, Arc/Arg3.1 interacts with Presenilin-1 a component of the γ-Secreatse complex. The processing of γ-Secreatse substrates APP and Notch1 is altered in an Arc/Arg3.1-dependend manner pointing to a function in endosomel sorting. However, it is still elusive how Arc/Arg3.1influences the endosomal sorting of Presenelin-1 and possibly AMPA receptors.
To answer this question and to get deeper insights into the molecular function of Arc/Arg3.1 we searched for new Arc/Arg3.1 binding partners in a Yeast-Two-Hybrid screen. Several of the identified new binding partners are associated with the endosomal system. In this work I investigated the colocalization and binding between Arc/Arg3.1 and three? of the newly identified proteins. I found that Sorting nexin-7 (SNX7) an uncharacterized member of the Sorting nexin family was a robust binding partner of Arc/Arg3.1. Sorting nexins are characterized by their phosphatidylinositol phosphate-binding PX domain that mediates the binding to specific membrane compartments. Additionally, SNX7 belongs to the BAR (Bin-Amphiphysin-Rvs) domain containing subfamily of Sorting nexins. These SNX-BAR proteins are crucial parts of the endosomal tubular machinery that sorts membrane proteins. Based on my in silico modeling of the SNX7 BAR domain and investigation of SNX7 mutants, I identified and characterized the Arc/Arg3.1 binding site. Mutations within this binding site had no effect on the formation of a SNX7/SNX4 heterodimer but prevent binding of Arc/Arg3.1. This heteromer is believed to be the functional entity for endosomal tubular sorting and capable of Arc/Arg3.1 binding. All three proteins colocalize at early endosomes and in dendritic spines of neurons. The distribution indicates that a subpopulation of Arc/Arg3.1 is associated with SNX7/SNX4 positive endosomes within the spines. Moreover, I found an association between SNX7 and CPG2 (candidate plasticity gene 2), an endocytic zone localized protein important in AMPA receptor endocytosis. SNX7 associates with components of the clathrin-dependent endocytosis machinery and increases the amount of internalized Transferrin. Amphiphysin-2 (APMH2), a known component of the endocytic machinery was also identified as a new Arc/Arg3.1 binding partner. AMPH2 and Arc/Arg3.1 are increasing transferrin internalization cooperatively suggesting a functional connection in Clathrin-dependent endocytosis. Investigating the expression of SNX7 in mouse brains and generating SNX7 KO mice, I found expression of SNX7 particularly in areas associated with learning and memory.
The results of my work show for the first time a physical link between Arc/Arg3.1 and the endosomal machinery that sorts membrane proteins. Additionally, Arc/Arg3.1 and SNX7 are both associated with Clathrin-dependent endocytosis and endosomal sorting in spines, suggesting a tight coupling of the two processes. The results of my studies lead to new insights into the molecular function of Arc/Arg3.1 and open up new explanations for the opposing effects of Arc/Arg3.1 in different forms of synaptic plasticity.

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