Biochemische und strukturelle Charakterisierung von YopM aus Yersinia enterocolitica WA-314 und dessen Wirts-Zielstrukturen

Abstract

Enteropathogene Bakterien der Gattung Yersinia haben die Fähigkeit entwickelt in lymphatischem Gewebe zu persistieren. Um der Abwehr des Wirts zu entgehen, haben diese Erreger ein sogenanntes Typ-III-Sekretionssystem entwickelt, mit dessen Hilfe sie eine Reihe von Immunmodulatoren, wie das in dieser Arbeit untersuchte YopM, direkt in Zielzellen wie Makrophagen injizieren. YopM-defiziente Yersinia-Mutanten haben kaum Überlebenschancen im Mausmodell (Kerschen et al. 2004). YopM wird mit einer Reihe immunmodulierender Effekte, wie der Stimulation oder der Hemmung der Ausschüttung von Interleukinen (Kerschen et al. 2004), oder der Aktivierung von Kinasen (McDonald et al. 2003) in Verbindung gebracht. Mehrere Interaktionspartner von YopM, extrazelluläre wie auch intrazelluläre, wurden beschrieben (Reisner & Straley 1992; Heusipp et al. 2006; McDonald et al. 2003; LaRock & Cookson 2012). Einer dieser Interaktionspartner ist die DEAD-Box-Helikase DDX3 (Hentschke et al. unveröffentlicht). YopM zeigt selbst in unterschiedlichen Serotypen ein- und derselben Art eine beträchtliche Variabilität v.a. in der Anzahl seiner „Leucine Rich Repeats“ (LRRs), die bei den bisher bekannten Formen von 13 bis 21 reichen kann. YopM aus Y. pestis 195/P (YopM_195/P) besteht aus 15 LRRs und das in dieser Arbeit untersuchte YopM aus Y. enterocolitica WA-314 (YopM_WA-314) besitzt 20 LRRs. Ziel dieser Arbeit war es I) YopM_WA-314 in Lösung allein und nach seiner Interaktion mit DDX3 durch „small angle X-ray scattering“ (SAXS) zu untersuchen; II) YopM_WA-314 zu kristallisieren, um es in die niedrig aufgelösten SAXS-Strukturen modellieren zu können; III) die Proteinbereiche sowohl in YopM als auch in DDX3 zu identifizieren, die für die Interaktion dieser beiden Proteine essentiell sind. Die Kristallstruktur von YopM_WA-314, die in der vorliegenden Arbeit gelöst wurde, zeigte, wie die Kristallstruktur von YopM_195/P, ein Tetramer. Dieses unterscheidet sich jedoch grundlegend von der YopM_195/P-Doppelhelixstruktur. Die Strukturanalyse des YopM_WA-314 ergab, dass das Kristall-Tetramer aus zwei physiologischen Dimeren besteht. Über eine Kontaktfläche von ca. 1000 Å2 interagieren hierbei zwei Monomere C-terminal über ihre konkave Seite. Die Bindung wird durch 13 Wasserstoffbrückenbindungen und 104 hydrophobe Wechselwirkungen vermittelt. Auf Grundlage dieser Daten konnte die Interaktion von YopM mit DDX3 näher charakterisiert werden. Hierbei handelt es sich um eine direkte, mäßig affine Bindung mit einer Kd von ~12 μM. Durch GST-Pulldown-Experimente konnte ermittelt werden, dass der flexible, unstrukturierte N-terminus der ATPase-Domäne von DDX3 unabdingbar für die Komplexbildung mit YopM ist. Die Analyse der Interaktion mittels analytischer Größenausschlusschromatographie und Röntgenkleinwinkelstreuung zeigte, dass der Komplex aus dem zuvor beschriebenen YopM-Dimer besteht, welches an der C-terminalen Dimerisierungsfläche ein Monomer von DDX3 bindet. Hierbei ragt der N-Terminus von DDX3 in die konkave Seite eines der YopM-Monomere und stabilisiert die Bindung. Diese Arbeit konnte somit die neue Kristallstruktur von YopM aus Y. enterocolitica WA-314 liefern und zum ersten Mal eine YopM-Struktur in Lösung präsentieren. Ebenso konnte mit Hilfe von SAXS ein sehr glaubhaftes Modell des Komplexes aus YopM und DDX3 erstellt werden. Die Art der hier dargelegten 2:1 Interaktion könnte eine Erklärung dafür liefern, wie YopM in der Lage ist, mehrere Proteine gleichzeitig zu binden und sie, wie für die auch interagierenden Kinasen RSK1 und PKN2 nachgewiesen, in einen ternären Komplex zu zwingen. Die Analyse der Auswirkung dieser Verbindungen auf die Wirtszelle könnte dabei helfen weiter Licht in die rätselhafte Rolle YopMs in der Yersinien-Infektion zu bringen.

Enteropathogenic bacteria of the genus Yersinia are able to persist in lymphatic tissues. To evade killing by the host immune system, the bacteria have developed a so called type III secretion system (TTSS). This system enables the bacteria to inject immune modulators like YopM into target cells like macrophages. YopM plays a major role in virulence in the mouse model and is said to reduce cytokine expression (Kerschen et al. 2004) but its mode of action remains enigmatic. Besides the so far unknown function, many extracellular and intracellular interaction partners for the protein could be described (Reisner & Straley 1992; Heusipp et al. 2006; McDonald et al. 2003; LaRock & Cookson 2012). One of these interaction partners is the DEAD box helicase DDX3 (Hentschke et al. unpublished). While most of the other Yops are highly conserved among species and serotypes, YopM displays certain variations in size and sequence. These differences are due to its variable number of Leucine Rich Repeats (LRRs) which differs from 13 to 21 in known species. YopM from Y. pestis 195/P (YopM_195/P) has 15 LRRs while YopM from Y. enterocolitica WA-314 (YopM_WA-314) which has been examined in this work consists of 20 LRRs. The aim of this study was to I) characterize YopM_WA-314 alone and together with DDX3 in solution via small angle X-ray scattering (SAXS); II) to crystallize YopM_WA-314 as a basis for modelling the complex into the low resolution structure; III) to identify the regions in both proteins that are essential for the interaction. The crystal structure of YopM_WA-314 that was solved in this work shows a tetramer in the asymmetric unit. This tetramer dramatically differs from the one found in Y. pestis. SAXS revealed that this tetramer is built by two physiological dimers. In these dimers two monomers overlap in a C-terminal region of ~1000 Å2. The dimer is stabilized by 13 hydrogen bonds and 104 non bonded interactions. Upon the basis of this structure the interaction of YopM and DDX3 could be further characterized. YopM binds DDX3 directly with moderate affinity with a Kd of ~12 µM. Via GST pulldown experiments it could be demonstrated that the N-Terminus of the Helicase is necessary for establishing the complex. The analysis of the complex with size exclusion chromatography and SAXS revealed that the YopM dimer binds a monomer of DDX3. In this model the globular domain-1 of DDX3 binds to the C-Terminal dimerization site of YopM and the N-terminus of DDX3 extends into the concave site of one YopM and stabilizes the complex. Thus this work presents the novel structure of YopM from Y. enterocolitica WA-314 and for the first time a structure of YopM in solution. Furthermore it is the first time that a reasonable model of the complex of the protein and a binding partner (DDX3) could be established. This 2:1 binding mode of YopM could deliver an explanation for how it deals with the parallel binding of two interaction partners that leads to the formation of a ternary complex, as described in the case of RSK1 and PRK2. The analysis of the influences those interactions might have on the host cells should help to shed light on the enigmatic role of YopM in Yersinia infection.