Characterization of interactions and trafficking of the Neuronal Ceroid Lipofuscinosis protein CLN3

Abstract

Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinoses (JNCL) is the most common neurodegenerative disease affecting children. This lysosomal storage disorder is caused by mutations in the cln3 gene and patients show characteristic lysosomal storage of autofluorescent lipoprotein. The CLN3 protein is mostly described as having six transmembrane domains and being localized to endosomal and lysosomal subcellular compartments. The function of the CLN3 protein is so far unknown but it has been linked to autophagy, lysosomal homeostasis, lipid modification, protein and vesicular trafficking, and cytoskeletal organization. In this thesis tagged CLN3 constructs were expressed in HeLa-cells and primary neuronal cultures. CLN3 localized primarily to lysosomal and late endosomal vesicular structures. There was little to no co-localization with markers for the Golgi, endoplasmatic reticulum or early endosomes. Moreover, in hippocampal neurons most CLN3 was found in somatic-dendritic areas with a minor population of CLN3-positive endosomes in spines. In the axon CLN3 is present to a lower degree. There it is involved in highly active fast axonal vesicular transport. To gain more insights into the cellular role of CLN3, the interaction of CLN3 with two new putative interaction partners, SorCS1 and Pen2, identified in TAP-tag screens, was analyzed. SorCS1 is a member of the Vps10p-Domain family of sorting receptors. Pen2 is a subunit of the γ-secretase. This protein complex consisting of four subunits – Pen2, Aph-1, Nicastrin and Presenilin – is a protease that cleaves transmembrane proteins with a single transmembrane domain. The best-known substrates are amyloid-precursor protein (APP) and Notch. Both putative new interaction partners for CLN3 have been associated with the neurodegenerative Alzheimer’s disease. In the course of this study the interaction of CLN3 with Pen2 was confirmed, but not the interaction with SorCS1. Co-expression of CLN3 and Pen2 mRNA in developing mice and co-localization of the proteins to the same subcellular structures, which were mainly late endosomes or lysosomes, was demonstrated. CLN3 and Pen2 were co-immunoprecipitated from cell lysates and co-trafficking of both proteins was observed. CLN3 and Pen2 show co-transport along axons and dendrites of primary hippocampal neurons and are involved in trafficking events in the somatic region of these neurons. In order to gain functional insight about the newly identified interaction the potential role of CLN3 in association with the γ-secretase complex was analyzed. CLN3 also shows partial co-localization with the γ-secretase associated proteins Presenilin 1 and APP. To assess if CLN3 regulates cleavage activity of the γ-secretase I established an assay that analyses γ-secretase-substrate-cleavage under CLN3-knockdown conditions. The results of this assay show a tendency which suggests an influence of CLN3-presence on γ-secretase cleavage activity. In conclusion, the presented data strongly supports a functional interaction of CLN3 and Pen2. This interaction may not only modulate γ-secretase cleavage activity. In addition, this interaction could play a role in recently discussed γ-secretase-independent activities of Presenilin 1 or Pen2 such as autophagy associated functions which in turn may be related to the development of neurodegeneration as observed in JNCL.

Die Juvenile Neuronale Ceroid Lipofuscinose (JNCL) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung bei Kindern. Diese lysosomale Speichererkrankung wird durch Mutationen in dem Gen cln3 hervorgerufen und führt zu einer charakteristischen Ablagerung von lysosomalem Speichermaterial, welches aus autofluroreszentem Lipoprotein besteht. Das Protein CLN3 wurde als Transmembranprotein mit sechs Transmembrandomänen beschrieben und hauptsächlich in endosomalen und lysosomalen subzellulären Kompartimenten gefunden. Die Funktion von CLN3 ist bisher nicht bekannt. Es wurde mit der Autophagy, der lysosomalen Homeostase, der Modifikation von Lipiden, dem Transport von Proteinen und Vesikeln sowie mit der Organisation des Zytoskelettes in Zusammenhang gebracht. In dieser Arbeit wurden getaggte CLN3-Konstrukte in HeLa-Zellen und primären hippokampalen Neuronen exprimiert. Lokalisiert wurden diese Konstrukte hauptsächlich in Lysosomen und späten Endosomen. Im Gegensatz dazu fand sich weniger CLN3 im Golgi, dem endoplasmatischen Retikulum oder frühen Endosomen. In hippocampalen Neuronen war CLN3 vor allem in der somato-dendritischen Region lokalisiert, wobei ein sehr geringer Anteil an Spines ebenfalls eine CLN3-Fraktion aufwies. Im Axon konnte eine kleine Population von CLN3-positiven vesikulären Strukturen beobachtet werden, die am schnellen axonalen Transport beteiligt waren. Um mehr über die funktionelle Rolle von CLN3 in der Zelle zu erfahren, wurden im Rahmen dieser Arbeit mögliche Interaktionspartner für CLN3 untersucht. Zwei neue putative Interaktionspartner – SorCS1 und Pen2 – wurden in TAP-tag Screens gefunden. SorCS1 ist ein Mitglied der Vps10p-Domänen Proteinfamilie, welche Sortierungs-Rezeptoren umfasst. Pen2 ist eine Untereinheit der γ-Sekretase. Dieser Proteinkomplex besteht aus den vier Untereinheiten Pen2, Aph-1, Nicastrin und Presenilin. Die γ-Sekretase wurde als Protease für Proteine mit einer Transmembrandomäne charakterisiert. Die am besten beschriebenen Substrate dieser Protease sind das Amyloid-Vorläufer Protein (APP) und Notch. Beide putativen neuen Interaktionspartner von CLN3 haben eine Verbindung zu der neurodegenerativen Alzheimer Erkrankung. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von CLN3 mit Pen2 bestätigt, jedoch konnte die Interaktion mit SorCS1 nicht untermauert werden. In Koexpressionsstudien von CLN3 und Pen2 mRNA wurde ein sehr ähnliches Expressionsmuster gefunden. Ebenso konnte eine Kolokalisation von CLN3- und Pen2-Protein in denselben subzellulären Strukturen beobachtet werden. Bei diesen handelt es sich hauptsächlich um späte Endosomen oder Lysosomen. CLN3 und Pen2 wurden aus Zelllysaten koimmunopräzipitiert und mittels Lebend-Zell-Mikroskopie wurde ihr Kotransport gezeigt. CLN3 und Pen2 werden in den gleichen Vesikeln entlang von Axonen und Dendriten von primär kultivierten Neuronen transportiert und sind an Fusionsprozessen in der somatischen Region dieser Neurone beteiligt. Um eine funktionelle Verbindung dieser neu identifizierten Interaktion zu zellulären Prozessen herzustellen, wurde die mögliche Bedeutung von CLN3 für den γ-Sekretase-Komplex untersucht. CLN3 zeigt eine partielle Kolokalisation mit den γ-Sekretase-assoziierten Proteinen Presenilin und APP. Um zu untersuchen, ob CLN3 einen Einfluss auf das Protease-Verhalten der γ-Sekretase hat, wurde in dieser Arbeit ein Assay etabliert, der die Spaltungsfähigkeit der γ-Sekretase auf Substrate unter CLN3-knockdown Bedingungen testet. Die Ergebnisse dieses Assays geben erste Hinweise auf den Einfluss von CLN3 auf die Protease-Aktivität der γ-Sekretase. Die Resultate dieser Arbeit weisen zum ersten Mal auf eine funktionelle Interaktion von CLN3 und Pen2 hin. Diese Interaktion moduliert möglicherweise nicht nur die Protease-Aktivität der γ-Sekretase, sondern könnte weiterhin auch bei anderen - γ-Sekretase unabhängigen – Funktionen von Presenilin 1 oder Pen2, eine Rolle spielen. So wurde Presenilin als Faktor für Autophagy diskutiert und eine Störung dieser Zellfunktion wurde auch mit der Neurodegeneration in JNCL assoziiert.