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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-71406
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7140/


Die Rolle des PDZ-Domänenproteins PIST bei der subzellulären Sortierung von Neurotransmitterrezeptoren

The role of the PDZ-domain containing protein PIST at the subcellular sorting of neurotransmitter receptors

Koliwer, Judith

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SWD-Schlagwörter: Proteine , Rezeptor , Zelle , Organell , Maus , Gehirn
Freie Schlagwörter (Deutsch): Neuronen , subzelluläre Sortierung , Neurotransmitter , GOPC , KO-Maus
Basisklassifikation: 42.63 , 35.70 , 42.13 , 35.62
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kreienkamp, Hans-Jürgen (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.10.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 26.05.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Das protein interacting specifically with TC10 (PIST) ist ein überwiegend am TGN lokalisiertes PDZ-Domänenprotein, das eine wichtige Rolle bei der subzellulären Sortierung von Membranproteinen einnimmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion von PIST sowohl an einem konkreten Beispiel, dem β1-adrenergen Rezeptors (β1AR), als auch in einem komplexen System, anhand einer Reihe von Interaktionspartnern im zentralen Nervensystem, untersucht.
Für β1AR konnten frühere Arbeiten bestätigt werden, die zeigten, dass PIST den Rezeptor im anterograden Transportweg am TGN zurückhält und dass PSD95, ein weiteres PDZ-Domänenprotein, β1AR aus dieser Interaktion löst und den anschließenden Transport zur Zelloberfläche ermöglicht. Dieses Modell wurde hier dahingehend erweitert, dass PIST, obwohl es mit PSD-95 um die PDZ-Bindestelle kompetiert, in vivo die Interaktion des Rezeptors mit PSD-95 fördert. Außerdem wurde nachgewiesen, dass sich dieses Modell auch in der Aktivität der Agonist-vermittelten Signaltransduktion des Rezeptors widerspiegelt. Weiterhin wurde die Rolle von PIST im postendozytotischen Transport von β1AR aufgeklärt. Hier zeigte sich, dass der durch Stimulierung des Rezeptors induzierte cAMP-Anstieg in der Zelle zu einer Umverteilung von PIST vom TGN zu späten Endosomen führt. Dort interagiert PIST mit dem endozytierten Rezeptor und hemmt dadurch sowohl dessen Recycling zur Zelloberfläche, als auch dessen lysosomalen Abbau.
Um einen Einblick in die Funktion von PIST in komplexen Systemen zu erhalten, wurde des Weiteren eine PIST-defiziente Mauslinie etabliert. Da homozygot PIST-defiziente Mäuse nur in wenigen Fällen lebensfähig waren, wurden hier im Wesentlichen heterozygote knockout-Tiere mit Wildtyp-Tieren verglichen. Bei PIST-heterozygoten Mäusen wurde ein signifikant reduzierter Blutglucosespiegel nachgewiesen. Dieses Ergebnis bestätigt das in der Literatur vorgeschlagene Modell, in dem PIST den Einbau des Glucosetransporters Glut4 in die Plasmamembran von Adipozyten inhibiert.
Im zentralen Nervensystem interagiert PIST mit wichtigen Komponenten der postsynaptischen Dichte (PSD), wie z.B. mit Neuroligin sowie mit den Neurotransmitterrezeptoren β1AR, mGluR5 und den NMDA-Rezeptoren. Durch Analyse von PIST-defizienten Mäusen, sowie von kultivierten Cortexneuronen, die einem lentiviralen PIST-knockdown unterzogen wurden, zeigte sich, dass PIST sowohl die Menge, als auch die subzelluläre Lokalisation seiner Interaktionspartner beeinflusst. So ist das Zelladhäsionsprotein Neuroligin1 in der PSD von PIST-heterozygoten Mäusen verstärkt angereichert. Von den ionotropen Glutamatrezeptoren waren AMPA-Rezeptoren verstärkt, NMDA-Rezeptoren dagegen reduziert in der PSD von PIST-heterozygoten Mäusen zu finden. Die Proteinmenge von mGluR5 war hingegen weder in Gesamtfraktionen, noch in der PSD von PIST-heterozygoten Tieren verändert. Eine deutliche Reduktion der Aktivität von Signaltransduktionswegen in Hippocampus-Lysaten impliziert, dass der Einbau von Rezeptoren in Signalkomplexe in PIST-heterozygoten Tieren gestört ist.
Kurzfassung auf Englisch: The protein interacting specifically with TC10 (PIST) is a mainly TGN-localized PDZ-domain containing protein that plays an important role in the subcellular sorting of membrane proteins. In this thesis, the function of PIST in the regulation of one specific interaction partner, the β1 adrenergic receptor (β1AR), as well as in the regulation of a variety of interaction partners in the central nervous system has been elucidated.
For β1AR previous work has been confirmed showing that β1AR is retained by PIST at the TGN in the anterograde pathway and rescued by PSD-95, another PDZ-domain containing protein, out of this interaction, facilitating its transport to the cell surface. This model has been extended by the fact that PIST, even if competing with PSD-95 for the interaction with the receptor, promotes the interaction of these proteins in vivo. Furthermore, it has been observed that the activity of the agonist-induced signaling pathway reflects the molecular situation. Besides the anterograde pathway, the role of PIST in the postendocytic pathway of β1AR has been investigated. The stimulation of the receptor induces an increase of the cellular cAMP level, leading to a redistribution of PIST from the TGN to late endosomes. Here, PIST interacts with the internalized receptor and inhibits its recycling to the cell surface, as well as its lysosomal degradation.
Furthermore a PIST-deficient mouse line has been established. Since very rarely homozygous PIST-deficient mice have been viable, mainly heterozygous knockout mice have been compared to wildtypes. A reduced blood glucose level has been observed in PIST-heterozygous mice. This fact supports the idea that PIST inhibits the transport of the glucose transporter Glut4 to the plasma membrane of adipocytes.
In the central nervous system PIST interacts with important components of the postsynaptic density (PSD) like Neuroligin and the neurotransmitter receptors β1AR, mGluR5 and NMDA-receptors. Performing lentiviral PIST-knockdown at cultured cortical neurons and analysis of PIST-heterozygous mice showed that the reduction of PIST levels influences the amount and the subcellular localization of its interaction partners. So, enrichment of the anchoring protein Neuroligin1 was detected in the PSD of PIST-heterozygous mice. Also the protein levels of ionotropic glutamate receptors were altered. Whereas the amount of AMPA receptors was enhanced, the amount of NMDA receptors was reduced in the PSD of PIST-heterozygous mice. However the amount of mGluR5 was not altered in the total protein level or in the PSD. The activity of different signal transduction pathways are drastically reduced in Hippocampus lysates of PIST-heterozygous mice. This result suggests that the anchoring of neurotransmitter receptors in signaling complexes is disturbed due to the reduction of PIST.

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