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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-77032
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7703/


Selektion, Charakterisierung und postselektive Modifikation eines Interleukin-6-Rezeptor Domäne 3 spezifischen RNA-Aptamers

Selection, characterization and post selective modification of an interleukin 6 receptor domain 3 specific RNA-aptamer

Mittelberger, Florian

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SWD-Schlagwörter: Aptamer , RNS , Biochemie , Interleukin 6
Freie Schlagwörter (Deutsch): SELEX , RNA-Protein Interaktion
Freie Schlagwörter (Englisch): RNA , IL-6
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.12.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 28.01.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Interleukin-6 (IL-6) nimmt eine Schlüsselposition in der Regulation von Entzündungen ein und ist der Hauptfaktor bei der Induktion der Akute-Phase-Proteinbiosynthese. Zusätzlich zu seiner zentralen Rolle in
vielen Aspekten des Immunsystems reguliert IL-6 eine Vielzahl homöostatischer Prozesse. Die Dysregulation von IL-6 kann jedoch zur Entstehung chronischer Entzündungen führen. Daraus folgend hat sich das Blockieren der IL-6-vermittelten Signaltransduktion als wirksame Indikation für die Behandlung verschiedener Autoimmun- und Krebserkrankungen, die mit chronischer Entzündung assoziiert sind, erwiesen. Diese Dissertation beschreibt die Selektion und Charakterisierung eines RNA-Aptamers für die Domäne 3 (D3) des Interleukin-6-Rezeptors (IL-6R). Die Selektion eines Protein-Domäne-spezifischen Aptamers wurde durch eine zweistufige systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) erzielt. Um Aptamere für den nativ gefalteten Rezeptor zu generieren, wurde zunächst löslicher IL-6R (sIL-6R) als Zielmolekül für die ersten drei Selektionszyklen eingesetzt. Die zweite Phase der SELEX erfolgte unter Verwendung der IL-6R D3, um nur diejenigen Aptamere mit Spezifität für diese Region des Rezeptors zu selektieren. Nach Abschluss der SELEX wurde die angereicherten Nukleinsäure-Bibliothek kloniert und sequenziert.
Die Auswertung der Sequenzierungsergebnisse resultierte in der Identifikation von fünf Sequenzfamilien, von denen drei in der Lage waren, den sIL-6R in Filterretentionsassays (FRA) zu binden. Keines der identifizierten Aptamere war jedoch zur Blockierung des sIL-6R für dessen Liganden IL-6 oder den signalweiterleitenden Co-Rezeptor Glykoprotein 130 (gp130) befähigt. F4, das Aptamer mit der höchsten Affinität für den sIL-6R (Kd ≈ 34 nM) wurde auf 34 nt minimiert. Die verkürzte Form wurde als RNA-Aptamer für die IL-6R Domäne 3 (RAID3) bezeichnet. Computergestützte Vorhersagen und CD-spektroskopische Messungen deuteten auf das Vorhandensein eines G-Quadruplexes als hauptsächliches strukturbestimmendes Merkmal von RAID3 hin. Die Bindung des Aptamers an den sIL-6R wurde durch die Verkürzung nicht eingeschränkt; Die Affinität von RAID3 für den sIL-6R (Kd ≈ 54 nM) entsprach dem des unverkürzten Vorläufers im FRA und konnte durch microscale Thermophorese verifiziert werden (Kd ≈ 27 nM). Durch konfokale laser scanning Mikroskopie und Durchflusszytometrie konnte
nachgewiesen werden, dass RAID3 zur Bindung an membrangebundenen IL-6R auf der XVI Oberfläche von BaF3 Zellen in der Lage ist und von diesen IL-6R-abhängig internalisiert wird. Abschließend wurde eine 2‘-Deoxy-2‘-fluoro-pyrimdin-Variante von RAID3 hergestellt, um die Stabilität des Aptamers unter Zellkulturbedingungen zu erhöhen. Während die Affinität von RAID3 durch die Modifikationen unbeeinflusst blieb (Kd ≈ 43 nM), konnte eine deutliche Zunahme der Stabilität in Zellkulturmedium mit fötalem Kälberserum nachgewiesen werden.
Kurzfassung auf Englisch: Interleukin-6 (IL-6) is a key player in inflammation and the main factor for the induction of acute phase protein biosynthesis. Further to its central role in many aspects of the immune system, IL-6 regulates a variety of homeostatic processes. Dysregulation of IL-6, however, can lead to chronic inflammation. Consequently, blockage of IL-6 signaling is an efficacious indication for the treatment of various autoimmune diseases and cancers associated with chronic inflammation. This thesis describes the selection and characterization of a RNA-aptamer capable of binding to domain 3 (D3) of the interleukin-6 receptor (IL-6R). The selection of a protein domain specific aptamer was achieved by applying a two tier systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Soluble IL-6R (sIL-6R) was used as target molecule for the first three selection cycles to generate aptamers capable of binding to the receptor in its native form. The second phase of the SELEX was performed using the D3 of the receptor to solely select aptamers specific for this region of the target molecule. The enriched nucleic acid library was cloned and sequenced after confirming its affinity for both sIL-6R and IL-6R D3. Evaluation of the sequencing results yielded five sequence families (F1-5), three of which showed binding to the IL-6R in filter retention assays (FRA). However, none of the aptamers tested was able to block the sIL-6R for its ligand IL-6 or the signaling co receptor glycoprotein 130 (gp130). F4, the aptamer with the highest affinity for the sIL-6R (Kd ≈ 34 nM), was minimized to 34 nt for further investigations and afterwards termed RNA aptamer for interleukin-6 receptor domain 3 (RAID3). Computational predictions and CD spectroscopy pointed to the presence of a G-quadruplex as the major structural determining feature of RAID3. Binding of the aptamer was not impaired by minimization; the affinity of RAID3 for the sIL-6R (Kd ≈ 54 nM) in FRA was comparable to its full length parent F4 and was later confirmed by microscale thermophoresis (Kd ≈ 27 nM). Laser scanning microscopy and flow cytometry experiments demonstrated that RAID3 was able to interact with the IL-6R on the surface of BaF3 cells. Finally, a 2’-deoxy-2’-fluoro-pyrimidine modified variant of RAID3 was prepared to enhance its stability under cell culture conditions. The fully modified RAID3 showed an unimpaired affinity for the sIL-6R (Kd ≈ 43 nM) and strongly enhanced stability in cell culture medium supplemented with fetal bovine serum.

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