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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-77165
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7716/


Structural Investigations of Hepatitis B virus X protein

Strukturuntersuchungen von Hepatitis-B-Virus X-Protein

Hussein, Rana Abdullah

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SWD-Schlagwörter: Röntgen-Kleinwinkelstreuung
Freie Schlagwörter (Deutsch): Röntgen-Kleinwinkelstreuung , Protein-Wechselwirkung , HBx protein
Freie Schlagwörter (Englisch): SAXS, protein interaction , HBx protein
Basisklassifikation: 35.26 , 35.29 , 35.79 , 35.76 , 42.32
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.01.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 16.02.2016
Kurzfassung auf Englisch: HBV is one of several liver-specific viruses that cause different severe
inflammation of this central metabolic organ. Chronic hepatitis B virus (HBV) infection affects over 2 billion people worldwide, 400 million are chronically infected with this virus and over 1 million patients die annually of HBV-related chronic liver disease. Although many individuals eventually achieve a state of non-replicative infection, the prolonged immunologic response to infection leads to the development
of cirrhosis, liver failure, or hepatocellular carcinoma (HCC) in up to 40% of individuals with chronic HBV infection. Several variables (age at infection, gender, ethnicity, immune status) also influence the risk of chronic infection. Immunization is the most effective mean of preventing HBV infection because till now there is no specific treatment for acute hepatitis B.Therefore, care is aimed to maintain comfort and adequate nutritional balance, which includes replacement of fluids lost from vomiting and diarrhea. Chronic hepatitis B infection can be treated with drugs. Treatment can slow the progression of cirrhosis, reduce the incidence of liver cancer and improve long term survival. HBV X protein (HBx protein) is a multifunctional regulator that plays a crucial
role in hepatocarcinogenesis. HBx protein is highly conserved among the different subtypes of the virus. It is present in the cytoplasm and, to a lesser extent in the nucleus of hepatocytes. The HBx protein is essential for establishing natural viral infection and has been implicated in the development of liver cancer associated with
chronic infection. This protein has been reported to exhibit a variety of different activities in tissue culture cells, including induction of cell death and stimulation of HBV replication. The HBx structural studies have been hampered by expression difficulties and as a result, no X-ray or NMR data are available for HBx up to date. The work presented in this thesis adds to the growing body of knowledge and expands the methods used to study the function/s of HBx, with particular emphasis on generating soluble protein within prokaryotic cells. In addition this work provides a solid argument in explaining some of the controversies around HBx proteins and delivers an enlightening description of the complex HBx protein. The bacterial strains are established systems that have been used by researchers to express a multitude of proteins of biomedical and biotechnological importance. The expression and purification of HBx proteins in bacterial strains was guided by previous studies. The cloning of these proteins using vectors containing an MBP tag was explored. This allowed purification of HBx to a high degree, including major improvements in the solubility of the proteins. The oligomeric structure determination of the fusion proteins was confirmed in solution by EM and SEC-SAXS. The proteins were expressed in the E.coli (DE3) strain in a soluble form with approximate molecular weights of 57, 57, 59 kDa for the DHBx, mini HBx and full HBx fusion proteins, respectively, after observation on SDS-PAGE. The proteins were purified with two chromatography steps using an amylose resin and a SEC superdex-200 column. Dynamic Light Scattering (DLS) was performed to characterize the proteins solutions. Single bands were observed with a hydrodynamic radius (RH) of 15.1, 18.2, and 20.0 nm for the DHBx, mini HBx and full HBx fusion proteins, respectively, corresponding to the molecular weights of the proteins and the existence of polydisperse particles in solution was demonstrated. Evidence of disorder in the secondary structure of HBx proteins using CD spectroscopy, with soluble, pure and E. coli derived HBx fusion proteins could not be detected due to the presence of the MBP tag, which showed stability of the HBx fusion proteins. Negative observations concerning the separation of the proteins after cleavage from the MBP suggested that the fusion proteins were only partially stable after cleavage from the tag. Several attempts to crystallize the proteins were undertaken. The protein crystals wereobserved to be weak, which reflects the merely partial stability of the HBx protein
structures. Negative staining EM was used to examine flexible macromolecules posing special difficulties regarding structure determination by crystallography or NMR. This procedure was performed for the DHBx fusion protein. The results show
the presence of different shaped particles, which tend to form a complex and long chain like particles, which are within the size of an oligomer, as detected when running the sample on a native gel. These results were confirmed by the SEC-SAXS for both DHBx and full HBx fusion proteins, which resulted in ab initio models containing an unstable part of the structure in the HBx proteins. The calculated
averaged molecular weights for both fusion proteins based on RI/RALS data were 800 and 660kDa for both DHBx and full HBx fusion proteins, respectively. The Rg values from the DHBx collected fractions from the second major peaks were 8.2-8.9 nm and Dmax of 35-39 nm. Also for the full HBx, the data showed Rg values of 9.5-10.1 nm and Dmax of 45-50 nm. The Rg values from the DHBx collected fractions from the first peaks were 16.0-19.5 nm and Dmax of 62-82nm. For the full HBx fusion protein, Rg values were 18.5-20.9 nm and and Dmax of 65-78nm. Another attempt was performed in this study by examining the interaction between the HBx proteins with p53 binding partners. This procedure was performed between both full and mini HBx fusion proteins with full length and C-terminal p53 proteins. The results indicate an interaction between both HBx and p53 proteins in the presence of both protein tags; this was observed when performing an affinity chromatography technique and following observation of the interacting proteins in the elution step. The results were confirmed by using an octet device, which is used for analysis of bimolecular interactions and binding kinetics. The KD value observed for the
interaction between mini HBx and full p53 proteins was 14.40±6.8nM, as well as 55.18±22nM for the interaction between both full HBx and full p53 proteins. Negative interactions were observed when obtaining free tagged p53 proteins, which showed no interaction to the HBx fusion proteins. These observations indicated that the interaction between both proteins was observed due to the presence of the GST tag
Kurzfassung auf Deutsch: HBV gehört zu einer Familie von leberspezifischen Viren, die zu verschiedenenschweren Entzündungen dieses zentralen Stoffwechselorgans führt. Das chronische Hepatitis B-Virus (HBV) infiziert mehr als 2 Milliarden Menschen weltweit, 400 Millionen sind chronisch mit diesem Virus befallen und über eine Millionen Patienten sterben jährlich an einer HBV-Infektion, in Zusammenhang mit
chronischen Lebererkrankungen. Obwohl viele Personen schließlich den Zustand einer nicht-replikativen Infektion erreichen, resultiert die verlängerte Immunantwort oftmals in der Entwicklung einer Leberzirrhose, einem Leberversagen oder in einem Leberzellkarzinom (HCC) und bis zu 40% der Patienten leiden an chronischer HBVInfektion.Mehrere Variable (Alter bei der Infektion, des Geschlechts, der ethnischen Zugehörigkeit, des Immunstatus) beeinflussen ebenfallsdas Risiko einer chronischen Infektion. Die Immunisierung ist das wirksamste Mittel zur Verhinderung von HBV-Infektionen, da bis heute keine spezifische Behandlung für akute Hepatitis B existiert.
Daher wird darauf ausgerichtet, auf eine angemessene
Ausgewogenheit der Ernährung zu achten, um den Ersatz von Flüssigkeiten aufrechtzuerhalten, die durch Erbrechen und Durchfall verloren gegangen sind.Chronische Hepatitis B-Infektion kann mit Medikamenten, einschließlich mit oralen antiviralen Mitteln behandelt werden. Die Behandlung kann das Fortschreiten der Leberzirrhose verlangsamen, das Auftreten von Leberkrebs reduzieren und zu langfristigem Überleben beitragen.Das HBV X-Protein (HBx Protein) ist ein multifunktioneller Regulator, welcher eine entscheidende Rolle bei Hepatokarzinogenese spielt. Das HBx Protein ist ein Transaktivator, der verschiedene virale und zelluläre Promotoren und Enhancer
aktivieren kann, dessen Aktivitäten für die virale Replikation notwendig sind. Das Protein ist innerhalb den verschiedenen Subtypen des Virus stark konserviert. Es ist im Cytoplasma vorhanden und in geringerem Maße auch im Kern von Hepatozyten. Das HBx Protein ist für die Festlegung der natürlichen Virusinfektion von Bedeutung und wird mit der Entwicklung von Leberkrebs und chronischer Infektion in Verbindung gebracht.Von diesem Protein wurde berichtet, dass es eine Vielzahl von verschiedenen Aktivitäten in Gewebekulturzellen besitzt, einschließlich der Induktion von Zelltod und dass es eine Stimulation der HBV-Replikation bewirkt. Von diesem Protein wurde berichtet, dass es eine Vielzahl von verschiedenen Aktivitäten in Gewebekulturzellen besitzt, einschließlich der Induktion von Zelltod und dass es eine Stimulation der HBV-Replikation bewirkt.Strukturelle Studien von HBX wurden bisher durch Schwierigkeiten während der Expressionerschwert und als Folge sind bis heute keine Röntgendiffraktions- oder NMR-Daten für HBx erhältlich. Darüber hinaus wurde die Rolle, die HBx bei Lebererkrankungen
spielt, durch transfektions-basierte Überexpressions-Systeme und physiologisch irrelevante zelluläre Modellen fälschlich interpretiert. Diese Methoden wurden versehentlich eingeführt und haben zu zahlreichen Artefakten in diesem Bereich beigetragen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse ergänzen das wachsende Wissen über HBx und ergänzen auch die eingesetzten Methoden, um die Funktion/en von HBx zu untersuchen. Ein besonderer Schwerpunkt liegt in der der Erzeugung von löslichem Protein aus prokaryotischen ZellenWeitergehend bietet diese Arbeit solide Argumente um einige der Kontroversen rund um HBx Proteine aufzuklären und liefert zusätzlich eine aufschlussreiche Studie des komplexen HBx Proteins. Die verwendeten Bakterienstämme sind etablierte Systeme, die von unterschiedlichsten Forschern eingesetzt wurden, um eine Vielzahl von Proteinen die Bedeutung in der Biomedizin und Biotechnologie haben, zu exprimieren. Die Expression und Reinigung von Proteinen in HBx-Bakterienstämmen wurde in dieser Arbeit im Einklang zu früheren Untersuchungen durchgeführt. Die Klonierung dieser Proteine wurde mittels Verwendung von Vektoren durchgeführt, die eine MBP-Markierung besitzen.Dies erlaubt die Reinigung von HBx zu einem hohen Grad, weiterhin führt es zu erheblichen Verbesserungen in der Löslichkeit der Proteine. Die oligomere Struktur der Fusionsproteine wurde in Lösung von EM- und SEC-SAXS-Messungen
bestätigt. Die jeweiligen DHBx-, Mini-HBx- und Voll-HBx Fusionsproteine wurden im E. coli (DE3)-Stamm in einer löslichen Form exprimiert, mit ungefähren Molekulargewichten von 57, 57 und 59 kDa, wie durch Beobachtung mittels SDS- PAGE gezeigt werden konnte. Die HBx-Proteine wurden mittels zwei Chromatographieschritten, unter Verwendung von Amylose-Harz einerseits und einer SEC Superdex-200-Säule andererseits, gereinigt. Dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde verwendet, um die Proteine in Lösung zu charakterisieren. Einzelne Banden wurden mit einem hydrodynamischen Radius (RH) von 15.1, 18.2 und 20.0 nm jeweils
für die DHBx, mini HBx und voll HBx Fusionsproteine bestimmt, entsprechend dem jeweiligen Molekulargewicht. Außerdem wurde das Vorliegen polydisperser Teilchen in Lösung beobachtet. Eine Beeinflussung der Sekundärstruktur der HBx-Proteine aufgrund der Anwesenheit des MBP-Tags wurde mit Verwendung von CDSpektroskopie beobachtet, und zwar für lösliche, reine und E. coli-abgeleitete HBx Fusionsproteine. Dies zeigt Auswirkungen auf die Stabilität der HBx Fusionsproteine. Nach der Abspaltung des MBP-Tags wurde beobachtet, dass die Fusionsproteine nur
noch teilweise stabil waren. Mehrere Versuche wurden unternommen um die Proteine zu kristallisieren. Erhaltene proteinkristall zeigten auch nach einer Optimierung nur schwache Röntgendiffraktion, was die nur teilweise stabile Struktur der HBx Proteine reflektiert. Negative Färbung EM wurde verwendet, um diese flexiblen Moleküle zu untersuchen, da sie kaum oder nicht geeignet sind für die Strukturbestimmung durch
Kristallographie oder NMR. Dieses Verfahren wurde mit den DHBx Fusionsproteinen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen die Anwesenheit von verschiedenen geformtenTeilchen, die einen Komplex bilden und zu langkettigen Partikeln neigen, die die
Größe eines Oligomers besitzen, wie auch durch native Gelelektrophorese gezeigt werden konnte. Dies wurde außerdem bei der Durchführung von SEC-SAXS, sowohl für die ab initio-Modelle von DHBx, als auch für Voll-HBx-Fusionsproteine, die einen instabil Teil der Struktur beinhalten, bestätigt. Die berechneten gemittelten
Molekulargewichte ergaben für beide Fusionsproteine, auf Basis von RI/RALSMessungen 800 und 660 kDa für jeweils das DHBx und für das Voll-HBx Fusionsprotein. Die Rg-Werte aus den DHBx gesammelten Fraktionen betrugen 8,2 bis 8,9 nm und der Dmax betrug 35-39 nm. Für das Gesamt-HBx-Protein ergaben die
Daten Rg-Werte von 9,5 bis 10,1nm und einen Dmax von 45-50 nm. Die Rg-Werte aus den DHBx gesammelten Fraktionen von den ersten peaks betrugen 16,0 bis 19,5 nm und der Dmax betrug 62-82 nm. Für das Gesamt-HBx-Protein ergaben die Daten Rg-Werte von 18.,5 bis 20,9nm und einen Dmax von 65-78 nm. In dieser Studie
wurde ein weiterer Versuch durchgeführt, der die Beobachtung der Wechselwirkung zwischen den HBx Proteinen und deren p53 Bindungspartnern betrifft. DieseExperimente wurden mit Voll- und Mini-HBx Fusionsproteinen mit voller Länge und
C-terminalen p53-Fusionsproteinen durchgeführt. Die Ergebnisse deuten auf eine Wechselwirkung zwischen den beiden HBx- und p53-Proteinen in der Gegenwart von beiden Protein-Tags hin. Dies wurde bei der Durchführung mittels einer speziellen
Affinitätschromatographie beobachtet, mit gezielter Beobachtung der Protein- Wechselwirkungen im Elutionsschritt. Diese Ergebnisse wurden durch die Verwendung eines Oktett-Geräts, welches für die Analyse von bimolekularen Wechselwirkungen und Bindungskinetiken verwendet wird, bestätigt. Der für die Interaktion zwischen mini und vollen HBx p53 proteinen beobachtete KD-Wert betrug
14,40 ± 6.8nm bzw. 55,18 ± 22 nm für die Wechselwirkung zwischen den beiden vollen HBx und vollen p53 proteinen. Keine Wechselwirkung konnte zwischen unmarkierten p53-Proteinen und HBx-Fusionsprotein beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen durch die
Anwesenheit des GST-Tags zu erklären ist.












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