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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-77988
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7798/


Modelling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific iPSC-derived engineered heart tissues

Modell der katecholaminergen polymorphen ventrikulären Tachykardie mit patientenspezifischen iPSC Herzgewebe

Letuffe-Brenière, David

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SWD-Schlagwörter: Stammzelle
Freie Schlagwörter (Deutsch): iPS , CPVT , Gewebekonstruktion
Freie Schlagwörter (Englisch): iPS , CPVT , tissue engineering , stem cell , disease modelling
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Eschenhagen, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.02.2016
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 31.03.2016
Kurzfassung auf Englisch: Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) is a Mendelian disease often
caused by mutations in the ryanodine receptor 2 (RyR2), in which life-threatening
arrhythmias depend on β-adrenergic stimulation. The disease was already successfully
modelled in vitro in single patient-specific induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived
cardiomyocytes, but studies in single cells ignore the complexity of cell-cell interaction.
Fibrin matrix-based 3-dimensional engineered heart tissue (EHT) can provide such a
multicellular complexity level. The aim of this study was the combination of the new
technique of patient-specific iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering to
establish a multicellular disease model for CPVT phenotype. Main parts of the study were
experiments to control the quality of the iPSC in long-term culture, the establishment of a
cardiomyocyte differentiation protocol and functional tests of patient-specific and control
EHTs.
To evaluate the behavior of iPSC over time of culture, different iPSC lines were transduced
with lentiviral gene ontology (LeGO) vectors encoding either red, blue or green fluorescent
protein and further selected by puromycin treatment, resulting in a unique colour in every
single cell. After being cultured for almost 40 passages, FACS analysis of two of the three cell lines, C25-old and BJ, showed that two and one sub-clones made up 95% or 90% of the
culture, respectively. The presence of such sub-clonal dynamic, in which the cells from a
common sub-clone overgrow all other cells during 40 passages, suggests to keep iPSC only
for 20 passages in culture.
To establish a multicellular disease model for CPVT phenotype, iPSC from two related
patients PAS5-641 and PAS7-763 with a missense mutation in the RYR2 and a control iPSC
line were differentiated into cardiomyocytes with a small molecule based, home-made
protocol. Cardiomyocytes were dissociated, embedded in a fibrinogen matrix around two
flexible silicone posts to make EHTs. Two to five weeks after casting, EHTs were analysed by
an automated video-optical recording system capable of continuous force measurements
and paced with carbon electrodes when required. Average contraction curves were
calculated on spontaneously beating patient-derived and control EHTs. A relaxation time
(T280%) of 157 ms (SD 27) was found for C25 (control) EHTs (n=9), while PAS5-641 and PAS7-
763 (patient-specific) had 231 ms (SD 50) (n=8) and 250 ms (SD 22) (n=2), respectively. EHTs
were then paced with increasing frequencies to study the frequency-dependent acceleration
of relaxation. While an increase in rate from 0.7 to 4 Hz decreased T280% from 275 ms (SD 18) to 105 ms (SD 22) in C25 control (n=7), T280% decreased from 350 ms (SD 82) to 145 ms (SD 27) at 3.4 Hz in PAS5-641 (n=10). The β-adrenergic agonist isoprenaline (100 nM) increased beating frequency from 45 bpm (SD: 6.3) to 88 bpm (SD: 17.4) in C25 (n=10) and from 36 bpm (SD 4.2) to 86 bpm (SD 17.4) in PAS5-641 (n=3). While isoprenaline did not induce
arrhythmias in either patient-derived EHT lines, overnight incubation in 5 mM calciumcontaining Tyrode´s solution induced beating irregularities in PAS7-763 EHTs, but not in C25
control. The irregularity could not be rescued by a RyR2 stabilising drug.
Taken together, the human iPSC-derived EHT model displayed most of the fundamental
mechanisms of heart models such as frequency-dependant acceleration of relaxation or
increase of frequency after β-adrenergic stimulation. Even though the disease-specific EHTs
did not show the expected phenotype of β-adrenergic induced arrhythmias, EHTs from both
the mother (PAS7-763) and the brother (PAS5-641) of a deceased index patient displayed
longer relaxation time than the control and arrhythmias when kept overnight in high calcium
Tyrode´s solution. However, none of these two EHT phenotypes, the longer relaxation time
or overnight arrhythmia, was rescued by a RYR2 stabiliser, casting doubts on the role of the
RyR2 mutation in the displayed phenotype.
Future experiments need to be done to decide whether phenotypes such as the calciuminduced arrhythmias and longer relaxation times are indeed mutation-specific or mere
variability between clones. Such experiments should include the systematic comparison of
EHTs from several healthy probands and patients with a RYR2 mutation that is definitely
genetically linked to a clinical CPVT phenotype.
Kurzfassung auf Deutsch: Katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT; englisch für
catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia) ist eine nach den Mendel’schen
Regeln autosomal-dominant vererbte Krankheit, die unter anderem durch Mutationen im
Ryanodinrezeptor (RyR2) verursacht wird und durch unter β-adrenerger Stimulation
auftretende lebensbedrohliche Arrhythmien gekennzeichnet ist. Ein bereits erfolgreich
etabliertes in vitro Modell für diese Krankheit verwendete einzelne Patienten-spezifische
Kardiomyozyten, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet
wurden. Allerdings können Untersuchungen an Einzelzellen die Komplexität von Zell-ZellInteraktionen nicht erfassen. Im Gegensatz dazu kann diese Komplexitätsebene mit d em hier
verwendeten, auf einer Fibrin-Matrix basierenden künstlichen Herzgewebe (EHT; englisch
für engineered heart tissue) sehr gut dargestellt werden. Das Ziel dieser Studie war daher die Kombination von Tissue Engineering mit Patienten-spezifischen Kardiomyozyten, die aus iPSZellen hergestellt wurden, um ein multizelluläres Krankheitsmodell für den CPVT-Phänotyp
zu etablieren. Hauptbestandteile der Studie waren Experimente zur Qualitätskontrolle von
iPS-Zellen in Langzeitkultur, die Etablierung eines Differenzierungsprotokolls für
Kardiomyozyten sowie die funktionelle Analyse von Patienten-spezifischen EHTs und
Kontroll-EHTs.
Um das Verhalten von iPS-Zellen über längere Kulturperioden zu studieren, wurden
verschiedene iPS-Zelllinien mit lentiviralen Vektoren transduziert, die für rot-, blau- oder
grün-fluoreszierendes Protein kodieren, so dass jede einzelne Zelle eine eindeutige Farbe
aufwies. Anschließend wurden die transduzierten Zellen mit Hilfe einer ebenfalls auf dem
Vektor kodierten Puromycin-Resistenz selektiert. Nach einer Kulturzeit von fast 40 Passagen
zeigten die Ergebnisse der FACS-Analyse, dass sich bei zwei der drei Zelllinien Sub-Klone, das heißt Zellpopulationen, die auf eine Mutterzelle zurückgehen, in den Kulturen durchgesetzt hatten. Bei C25-alt (hohe Passagenummer) bestanden 95% der Zellen aus zwei Sub-Klonen,
und bei BJ ließen sich 90% der Zellen auf eine einzige Mutterzelle zurückführen. Das
Vorhandensein dieser Dynamik, bei der die Zellen eines einzelnen Sub-Klons alle anderen
Zellen innerhalb von 40 Passagen überwachsen, legt nahe, iPS-Zellen nur für etwa 20
Passagen in Kultur zu halten.
Für die Etablierung eines multizellulären Krankheitsmodells für den CPVT-Phänotyp wurden
Proben von zwei verwandten Patienten verwendet. IPS-Zellen von PAS5-641 und PAS7-763,
die beide eine Mutation im Gen für den Ryanodinrezeptor tragen, sowie einer Kontroll Zelllinie wurden mit einem eigenen, auf kleinmolekularen Substanzen basierenden Protokoll
zu Kardiomyozyten differenziert. Diese wurden dann zwischen zwei flexiblen
Zusammengefasst eignen sich humane iPS-EHTs also dazu, grundlegende Mechanismen der
Herzfunktion wie zum Beispiel post-rest potentiation, die Erhöhung der Schlagfrequenz nach
β-adrenerger Stimulation und den positiv-lusitropen Effekt der Steigerung der
Schlagfrequenz darzustellen (siehe oben). Obwohl die krankheitsspezifischen EHTs nicht den
erwarteten Phänotyp der durch β-adrenerge Stimulation induzierten Arrhythmien zeigten,
hatten EHTs beider Patienten, das heißt von der Mutter (PAS7-763) und des Bruders (PAS5-
641) des verstorbenen Patienten eine längere Relaxationszeit als die Kontrollen und zeigten
Arrhythmien bei Übernacht-Inkubation in Tyrode mit hoher Ca 2+-Konzentration. Jedoch
konnten diese phänotypischen Merkmale nicht durch eine RYR2-stabilisierende Substanz
verbessert werden, was die Rolle dieser Mutation für den Krankheitsphänotyp in Frage stellt.
Deshalb sind zukünftige Experimente nötig, um zu entscheiden, ob phänotypische
Merkmale wie die lange Relaxationszeit oder die Ca2+-induzierten Arrhythmien tatsächlich
mutationsspezifisch sind oder ob es sich schlichtweg um Variabilität verschiedener iPS Zelllinien handelt. Besonders wichtig hierfür ist der systematische Vergleich von EHTs, die
von verschiedenen gesunden Probanden stammen, mit EHTs von Patienten, deren RYR2-
Mutation durch genetische Untersuchungen definitiv mit einem klinischen CPVT-Phänotyp
assoziiert sind.

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