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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78297
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7829/


Transmembrane carriers of cardenolide-adapted leaf beetles (Coleoptera, Chrysomelidae)

Membrantransporter bei Cardenolid-adaptierten Blattkäfern (Coleoptera, Chrysomelidae)

Baum, Michael

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SWD-Schlagwörter: Cardenolide , Blattkäfer , Sequestration , Membrantransport , Carrier-Proteine
Freie Schlagwörter (Deutsch): Kotmaske , ABC Transporter , Oatp , Kompartimentierung , spezialisierte Metabolite
Freie Schlagwörter (Englisch): carrier proteins , cardenolides , sequestration , ABCB transporter , Oatp
Basisklassifikation: 42.63 , 42.21 , 42.75 , 42.13 , 42.18
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dobler, Susanne (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.03.2016
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 31.03.2016
Kurzfassung auf Englisch: In the constant evolutionary arms race between plants developing new
defense mechanisms and herbivorous animals struggling to overcome them, a general strategy of plants is the production of specialized metabolites with toxic or deterrent effects. Insects have evolved methods to circumvent these toxins and have sometimes taken the strategy one step further by sequestering and using the substances for their own defense. This often requires specialized transmembrane carrier proteins for the selective uptake, excretion, transport and compartmentalization of substances in different tissues. In this dissertation, such carrier proteins are investigated in two leaf beetles whose host plants produce toxic cardenolides. As cardenolide transporters have been found in protein subfamily B of ABC transporters (ABCB) and among Oatps (organic anion transporting polypeptides, SLCO gene family), representatives of these groups were hypothesized to be involved in beetles as well.
The imagines and larvae of the onion leaf beetle Lilioceris merdigera feed on cardenolide-rich lily of the valley (Convallaria majalis). Larvae of L. merdigera
wear a fecal mask, and tracer feeding experiments showed retention of ingested cardenolides in the fecal material. Choice assays demonstrated a deterrent effect of the cardenolide digoxin as well as C. majalis-derived fecal
masks on a generalist ant predator. Though the use of plant-derived compounds in fecal defense of larvae is well known, this is the first evidence of
any involvement of cardenolides. Interestingly, ABCB transporters were identified and, immunohistochemically detected at the apical membrane of the beetle’s midgut, where they potentially mediate an active cardenolide barrier.
Cardenolides produced by apocynaceous plants are sequestered by the golden dogbane leaf beetle Chrysochus auratus and the co-generic C. cobaltinus. The mode of uptake and transport is so far unknown, as is the method by which the beetles manage to protect their sensitive nervous tissue from the toxic effects of cardenolides. Looking for potential cardenolide transporters, three Oatps from C. auratus and their respective homologues from its non-sequestering sister species C. asclepiadeus were identified and functionally expressed in Xenopus oocytes. In transport assays, they transported neither the cardenolide ouabain, nor the mammalian Oatp model allocrites estrone-3-sulfate (E3S) and taurocholate (TC), indicating differing allocrite spectra of beetle and mammalian Oatps. One Chrysochus Oatp, Oatp74D, was shown to transport bromosulfophthalein (BSP). Thus, it is unlikely that Oatps play a role in cardenolide transport in Chrysochus. Using bioinformatics, including a structural 3D model of Oatp30B from C. auratus, conserved structures, motifs and amino acids reported to be involved in transport function were identified. Several features and motifs are conserved between insect and mammalian Oatps, but the variation found across the majority of the amino acid residues may account for different allocrite spectra.
Furthermore, three ABCB full transporters were identified in C. auratus, two of which are strongly expressed in the nervous tissue. These transporters may act as cardenolide exporters in the beetle’s perineurium, protecting the nervous tissue from sequestered toxins in the hemolymph. A phylogenetic analysis suggests the presence of duplications of ABCB transporter genes within beetle lineages.
The question of cardenolide uptake and transport mechanisms in Chrysochus remains unanswered. However, some evidence suggesting ABCB transporters are involved in compartmentalization processes as an adaptation of leaf beetles to cardenolide-containing host plants is presented.
Kurzfassung auf Deutsch: Im fortlaufenden evolutionären Wettrüsten zwischen Pflanzen, die neue Verteidigungsmechanismen entwickeln, und Pflanzenfressern, die diese wieder überwinden, besteht eine übliche Strategie der Pflanzen in der Produktion von giftigen oder abschreckenden Sekundärmetaboliten. Insekten haben Methoden entwickelt, um die giftige Wirkung zu umgehen und die Substanzen manchmal obendrein für ihre eigene Verteidigung einzusetzen. Diese Methoden erfordern häufig die Existenz von Transmembrantransportern für selektive Aufnahme, Ausscheidung, Transport und Kompartimentierung der Substanzen in bestimmten Geweben. In dieser Arbeit werden Transportproteine zweier Blattkäfer untersucht, die in ihren Fraßpflanzen mit giftigen Cardenoliden konfrontiert sind. Da aus der Unterfamilie B der ABC-Transporter und aus der Familie der Oatps (organische Anionen transportierende Polypeptide, Genfamilie SLCO) bereits Cardenolidtransporter bekannt sind, lag die Hypothese nahe, dass Vertreter dieser Gruppen den Cardenolidtransport auch bei Käfern bewerkstelligen.
Das Maiglöckchenhähnchen Lilioceris merdigera frisst als Imago und im Larvalstadium an cardenolidreichen Maiglöckchen (Convallaria majalis). Die Larven tragen eine Kotmaske. Fütterungsversuche mit radioaktiv markierten Cardenoliden zeigten, dass diese mit dem Kot wieder ausgeschieden werden. In Wahlversuchen konnte ein abschreckender Effekt des Cardenolids Digoxin sowie der Kotmasken von Larven, die Maiglöckchen gefressen hatten, auf generalistische räuberische Ameisen nachgewiesen werden. Obgleich die Verwendung von Verbindungen aus Pflanzen in der kotbasierten Verteidigung von Blattkäferlarven wohlbekannt ist, sind dies erste Belege für eine Beteiligung von Cardenoliden. Es wurden außerdem ABCB-Transporter identifiziert und immunohistochemisch in der apikalen Membran des Mitteldarmepithels der Käfer nachgewiesen, wo sie möglicherweise eine aktive Barriere für Cardenolide erzeugen.
Die Blattkäfer Chrysochus auratus und C. cobaltinus sequestrieren Cardenolide, die von Apocynaceen, ihren Fraßpflanzen, produziert werden. Die Art und Weise der Aufnahme und des Transports der Substanzen ist bislang ebenso unbekannt, wie die Methode, mit welcher die Käfer ihr sensitives Nervengewebe vor der giftigen Wirkung schützen. Auf der Suche nach potentiellen Cardenolidtransportern wurden drei Oatps von C. auratus und entsprechende Homologe der nichtsequestrierenden Schwesterart C. asclepiadeus identifiziert und in Xenopus Oocyten funktionell exprimiert. In Transportversuchen wurde gezeigt, dass diese Proteine weder das Cardenolid Ouabain, noch Estron-3-Sulfat (E3S) und Taurocholat (TC) transportieren, welche als Standard-Transportsubstrate von Säugetier-Oatps gelten. Dies weist auf unterschiedliche Transportsubstratspektren von Käfer- und Säuger-Oatps hin. Eines der Oatps von Chrysochus, Oatp74D, transportierte Bromosulfophthalein (BSP). Oatps spielen somit höchstwahrscheinlich keine Rolle beim Cardenolidtransport in Chrysochus.
Mit Hilfe eines dreidimensionalen Strukturmodells des Oatp30B von C. auratus und weiteren bioinformatischen Methoden wurden konservierte Strukturen, Motive und Aminosäuren identifiziert, welche an der Transportfunktion der Säugerproteine beteiligt sein sollen. Zwischen Insekten- und Säuger-Oatps finden sich zahlreiche konservierte Motive und Strukturen, allerdings könnten die Abweichungen an den meisten Aminosäurepositionen für unterschiedliche Transportsubstratspektren verantwortlich sein.
Des Weiteren wurden drei ABCB-Transporter in C. auratus identifiziert, von denen zwei eine starke Expression im Nervengewebe aufweisen. Sie könnten als Cardenolidexporter im Perineurium des Käfers fungieren und so das Nervengewebe vor sequestrierten Cardenoliden in der Hämolymphe schützen. Eine phylogenetische Analyse deutet auf Duplikationen von ABCB-Transportergenen in einigen Abstammungslinien von Käfern hin.
Die Cardenolidaufnahme- und -transportmechanismen in Chrysochus bleiben vorerst ungeklärt, allerdings wurden Hinweise für eine Beteiligung von ABCB-Transportern an Kompartimentierungs-vorgängen als Anpassung von Blattkäfern an cardenolidhaltige Fraßpflanzen gefunden.

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