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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78438
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7843/


Analyse der humoralen, neutralisierenden Immunantwort nach natürlichen Infektionen mit Dengueviren

Analysis of the humoral neutralizing immune response after natural infections with dengue viruses

Auerswald, Heidi

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SWD-Schlagwörter: Denguefieber , Immunreaktion , Antikörper
Freie Schlagwörter (Deutsch): Neutralisation
Freie Schlagwörter (Englisch): neutralization
Basisklassifikation: 42.32
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.04.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 12.04.2016
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurden 280 Seren von DENV Patienten aus Kambodscha, Vietnam, Kolumbien und Burkina Faso auf ihre Serotyp-spezifische Neutralisation untersucht. Die Ergebnisse der Neutralisationsexperimente basieren auf über 1600 Tests mit DENV1-4 WHO Referenzviren sowie acht Dengue-Patientenisolaten aus Kambodscha. Die Virusneutralisation im Serum wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion bestimmt, mit dem Denguevirus-Serotyp aus der akuten Phase der Infektion und mit der Serumreaktivität gegenüber rekombinanten ED3 Antigenen (DENV1-4) verglichen. Dadurch ergaben sich folgende Erkenntnisse: Die Neutralisation gegen den infizierenden Serotyp im Patienten war vermindert und die Entwicklung einer Neutralisationsprävalenz gegen diesen Serotyp war auch einen Monat später nicht zu beobachten. Die höchsten Neutralisationstiter wurden gegen Denguevirus-Serotypen gemessen, die nicht Auslöser der Infektionen waren. Im Vergleich der Neutralisationsdaten mit dem Antigentest wurde eine Korrelation zwischen der Serotyp-spezifischen Neutralisation und der Bindung an das entsprechende ED3* Antigen beobachtet. Der ED3*-Antigentest ist daher geeignet den aufwendigen Neutralisationstest zu ersetzen. Dies hat Vorteile, speziell bei der Untersuchung des Immunstatus in weiten Bevölkerungsteilen endemischer Gebiete.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Vektorsystem zur Herstellung DENV-pseudotypisierter HIV-1-Partikel entwickelt. Dafür wurden Expressionsvektoren für die prM/E-Hüllproteine von DENV1, DENV2, DENV3, DENV4 und einem chimären DENV2-JEV-Konstruktes hergestellt. Die Expression der Proteine wurde in verschiedenen eukaryotischen Zelllinien optimiert. Für die Bildung der Partikel wurden zwei HIV-1-Vektoren verwendet, die sich in ihrem Genotyp (env, nef und vpr) unterschieden. Dabei stellte sich pNL4-3-Luc-AM als der optimale Retrovirusvektor heraus, da er nef+, vpr+ war und sich das Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des SV40 Promotors befand. Für alle fünf DENV prM/E-Konstrukte wurden infektiöse, pseudotypisierte HIV-1-Partikel hergestellt, deren Infektion von VeroB4 Zellen quantitativ durch Nachweis der Luciferaseaktivität bestimmt wurde. Dieses etablierte System eignet sich für die Untersuchung von prM/E Varianten in allen Flaviviren und eröffnet neue Möglichkeit den Hüllprotein-abhängigen Infektionsweg zu studieren.
Kurzfassung auf Englisch: In this study, the serotype specific neutralization of 280 sera of DENV patients from Cambodia, Vietnam, Columbia and Burkina Faso were analyzed. In total, about 1600 single experiments with DENV1-4 WHO virus reference strains and 8 dengue isolates from patients in Cambodia were performed. Virus neutralization of sera was analyzed at different time points after infection, compared to the serotype of dengue viruses from the acute phase of infection and also compared to serum reactions against recombinant ED3 antigens representing all four dengue viruses. Using the abovementioned assay set up, the following observations could be made: Neutralization against the acutely infecting DENV serotype of the patient was reduced and the development of a dominating antibody response against this serotype could not be detected one month after infection. Highest neutralization titers were observed against serotypes that did not cause the infections. Comparison of neutralization results with the outcome of the antigen test led to a positive correlation of serotype specific neutralization and binding to the corresponding ED3* antigen. Due to this, the ED3* antigen assay was deemed suitable for replacing the elaborate neutralization test. Because of its less elaborate set-up, the antigen assay is especially beneficially when investigating the immune status in large parts of the population in endemic areas.
Additionally, a vector system for the production of DENV pseudotyped HIV-1 particles was established. To do so, expression plasmids encoding prM/E envelope proteins of DENV1, DENV2, DENV3, DENV4 and of an chimeric DENV2-JEV construct were generated. Expression of these proteins was optimized in various eukaryotic cell lines. Induction of particle assembly was tested with two different HIV 1 vectors. They differed in their genotypes for env, nef and vpr. As a result vector pNL4-3-Luc-AM was found to be the best because of its nef+ vpr+ genotype and due to the fact that the luciferase reporter gen that was controlled by a SV40 early promoter. All five DENV prM/E constructs drove infectious pseudotyped HIV-1 particles. Their infectivity could be detected quantitatively by measuring luciferase activity in VeroB4 cells. The established vector setup is applicable for the investigation of prM/E variants in all flaviviruses and initiates new opportunities for research on the envelope dependent infection mechanism.

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