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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78577
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7857/


Structural and Functional Analyses of Secretory and Excretory Proteins from Onchocerca volvulus as Basis for Rational Drug Design

Moustafa, Amr

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Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.04.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 27.04.2016
Kurzfassung auf Englisch: Approximately 18 million people around the world (99 % living in Africa) are infected with onchocerciasis and 270,000 become blind, 500,000 visually impaired upon infection. O.volvulus, a filarial parasite, is a master regulator of host immune responses, developing complex mechanisms to depress host protective Th2-type responses and promotes long-term persistence. Although various treatments have been developed against onchocerciasis, ivermectin turned out to be most effective choice. However, ivermectin is only effective against microfilariae and adverse effects, as well as an emerging resistance has been reported due to extensive treatment with ivermectin. Helminth-derived molecules can be used as tools to identify the underlying mechanisms of immune regulation or to determine new anti-inflammatory and filaricide therapeutics. One approach is to identify the excretory/secretory products (ESPs) that play an essential role in parasite/host interaction. Due to their extracellular accessibility, ESPs represent suitable targets for the development of new control strategies. Inactivation of these products may help to weaken the defense mechanisms of the parasite and may enable the host to eliminate the parasite. Among many important possible drug targets or vaccine candidates, two proteins, known as extra cellular superoxide dismutase enzyme (OvEC-SOD) and the immunodominant hypodermal antigen 2 (Ral-2), particularly attract attention and are structurally characterized within this study. The genes encoding for OvEC-SOD and the Ov Ral-2 were successfully cloned and expressed in E. coli. Both proteins could be crystallized and structural models were obtained applying X-ray diffraction. The oligomeric state, observed in the crystal structures, were confirmed in solution by small-angle X-ray scattering (SAXS). For prodrug development, a subset of uncharged poly aromatic compounds, with molecular weights in the range of 200–700 Da, have been tested in vitro for anti Cu/Zn activity. Three inhibitors were selected upon their high binding energy. Interestingly, these compounds bind human Cu/Zn SOD unspecifically with low docking scores. Although the function of Ov Ral-2 is unknown, it is considered as one of the most promising vaccine candidates. The structure-function relationship of Ov Ral-2 was investigated. The structural model showed unusual topology, which can be described as two identical rings interlocking in a knot-like structure. The interesting distribution of charges and aromatic amino acids elucidate the possible role of this protein- protein interaction. This work contributes towards a better understanding of the immunotherapeutic strategy and can support the development of a novel therapeutic agent or a new vaccine and may support new diagnostic tests.
Kurzfassung auf Deutsch: Weltweit sind über 18 Millionen Menschen mit dem Erreger der Flussblindheit Onchocerca volvulus infiziert, wobei 270.000 Menschen aufgrund der Erkrankung erblinden und bei weiteren 500.000 Menschen die Sehkraft eingeschränkt ist. O.volvulus, ein Filarien Parasit, wirkt als ein Master-Regulator der Wirtsimmunantwort, indem er die Entwicklung von komplexen Mechanismen zur Wirtsschutz-Reaktionen des Th2-Typs unterdrückt und damit seine Persistenz fördert. Obwohl verschiedene therapeutische Ansätze gegen Onchozerkose entwickelt wurden, hat sich insbesondere Ivermectin als am wirkungsvollsten herausgestellt. Jedoch ist Ivermectin nur gegen Mikrofilarien wirksam und ferner wurde von Nebenwirkungen und Resistenzentwicklungen durch umfangreiche Behandlung mit Ivermectin berichtet. In einem neuen, alternativen Ansatz werden Helminth-abgeleiteten Molekülen verwendet, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Immunregulation zu identifizieren, oder um neue entzündungshemmende und filaricide Therapeutika zu entwickeln. Dabei werden die exkretorischen/sekretorischen Produkte (ESPs), die eine wesentliche Rolle bei Parasit/Wirt-Interaktion spielen, identifiziert. Aufgrund ihrer extrazellulären Zugänglichkeit stellen ESPs offensichtliche Ziele für die Entwicklung neuer Kontrollstrategien dar. Die Inaktivierung dieser Produkte kann helfen, die Abwehrmechanismen des Parasiten zu schwächen und es dadurch zu eliminieren. Unter vielen wichtigen Drogenzielen oder Impfstoffkandidaten stechen zwei Proteine besonders heraus, das Enzym Superoxid Dismutase (SOD) und das immun hypodermale Antigen 2 (Ov Ral-2). Diese sollten im Rahmen dieser Arbeit strukturell charakterisiert werden.
Die Gene die für die Proteine OvEC-SOD und Ov Ral-2 kodieren wurden kloniert und erfolgreich in E. coli exprimiert. Beide Proteine konnten kristallisiert werden und mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse konnte ein Strukturmodell erstellt werden. Der in der Kristallstruktur beobachtete oligomere Zustand wurde in Lösung durch Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) bestätigt. Im Rahmen der Prodrug-Entwicklung, wurde eine Untergruppe ungeladener polyaromatischer Verbindungen mit Molekulargewichten im Bereich von 200-700 Da in vitro auf ihre Anti Cu/Zn Aktivität hin untersucht, wobei IC50 Werte im mikromolaren Bereich gemessen wurden. Drei Inhibitoren wurden aufgrund ihrer hohen Bindungsenergie ausgewählt. Aufgrund von Docking-Studien wurde identifiziert, dass diese Verbindungen menschliche Cu/Zn-SOD unspezifisch binden. Obwohl die Funktion von Ov Ral-2 unbekannt ist, gilt es als einer der vielversprechendsten Impfstoffkandidaten. Aufgrund dessen wurde die Struktur-Funktions-Beziehungen von Ov Ral-2 untersucht. Die Struktur weisst eine ungewöhnliche Topologie auf, die zwei identische Ringe in einer knotenartigen Struktur darstellt. Die Protein-Protein-Interaktion kann aufgrund der interessanten Verteilung der elektrostatischen Ladungen und aromatischen Aminosäuren erklärt werden. Diese Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis der immuntherapeutischen Strategie und der Herstellung von neuen therapeutischen Wirkstoffen bei und leistet einen wesentlichen Beitrag für die Entwicklung neuer diagnostischer Tests.

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