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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78622
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7862/


Role of the cytomegalovirus early 1 protein isoforms during viral replication

Die Rolle der Cytomegalovirus Early 1 Isoformen während der viralen Replikation

Schommartz, Tim

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Basisklassifikation: 42.32
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Brune, Wolfram (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.04.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 03.05.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Die Genome der Herpesviren gehören zu den größten und komplexesten Genomen aller humanpathogenen Viren. Cytomegaloviren, die größten Vertreter der Herpesviren, kodieren dabei über 170 Gene von denen in den meisten Fällen ungespleißte Transkripte erzeugt werden. Durch neuere Studien wurde allerdings deutlich, dass eine nicht zu vernachlässigende Anzahl der cytomegaloviralen Transkripte gespleißt wird. Unter diesen findet man auch einige Transkripte, welche durch alternatives Spleißen entstehen. Ein Vorgang durch den ein einzelnes Gen mehrere Protein Isoformen kodieren kann. Die vier viralen Early 1 (E1) Isoformen werden, sowohl bei dem murinen Cytomegalovirus (MCMV) als bei dem humanen Cytomegalovirus (HCMV), von solch alternativ gespleißten viralen Transkripten kodiert. In MCMV werden die E1 Proteine durch die M112/113 Genregion kodiert, in HCMV durch den homologen UL112/113 Genlokus. Obwohl diese Genregionen essentiell für die virale Replikation sind, ist erstaunlich wenig über sie bekannt. Erst in jüngster Zeit wurde damit begonnen, die Funktion(en) individueller E1 Isoformen zu studieren. Da jedoch Standardmethoden der Virusmutagense, wie die Konstruktion viraler knockout oder nonsense Mutanten, in der Regel alle E1 Isoformen betreffen, gestaltet sich die Untersuchung einzelner E1 Isoformen als äußerst schwierig. Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode ermöglicht das selektive Inaktivieren einzelner E1 Isoformen durch den gezielten Einsatz von Mutation der Spleißakzeptor- und Spleißdonorsequenzen; sowie durch Deletion von Introns und Substitutionsmutagense. Durch Einsatz dieser Techniken wurde der Einfluss der Inaktivierung einzelner E1 Isoformen auf die virale Replikation in Fibroblasten, Endothelzellen und Makrophagen untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die größte E1 Isoform (p87), jedoch nicht die anderen drei E1 Isoformen (p33, p36 und p38), essential für die Replikation von MCMV in Zellkultur sind. Interessanterweise ist allerdings mindestens eine der mittelgroßen E1 Isoformen (p36 oder p38), sowie das erste Intron der M112/113 Genregion, unabhängig von dessen spezifischer Sequenz, zwingend für die virale Replikation erforderlich. Durch Verwendung analoger Methoden für die UL112/113 Genregion konnten ähnliche Effekte auch für die Inaktivierung einzelner HCMV E1 Isoformen beschrieben werden.Zusätzlich wurden potentielle zelluläre Interaktionspartner für die große MCMV E1p87 Isoform mit Hilfe einer SILAC basierten Kombination von Affinitätsaufreinigung und Massenspektrometrie identifiziert. Die unter diesen potentiellen Interaktionspartnern enthalten Proteine aus der Gruppe der heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP) wurden dabei weiterführend untersucht.
Kurzfassung auf Englisch: Herpesviruses have large and complex DNA genomes. The largest among the herpesviruses, the cytomegaloviruses, encode over 170 genes. Although most herpesviral gene products are expressed from unspliced transcripts, a substantial number of viral transcripts are spliced. Some viral transcripts are subject to alternative splicing, which leads to the expression of several proteins from a single gene. The four isoforms of the Early 1 (E1) proteins of both the murine cytomegalovirus (MCMV) and the human cytomegalovirus (HCMV) are encoded by such alternatively spliced gene transcripts. These transcripts are derived from the MCMV M112/113 gene and its homolog in HCMV, UL112/113. Surprisingly little is known about these essential genes and only very recently the different E1 isoforms have begun to be studied individually. Functional analysis of the individual E1 proteins is difficult as deletion and nonsense mutagenesis, both common methods used in the generation of viral gene knockout mutants, affect several or all E1 isoforms at the same time. Here I demonstrate that individual E1 gene products can be inactivated selectively by mutagenesis of the splice donor or acceptor site and by intron deletion or substitution mutagenesis. The expression of each of the four MCMV E1 protein isoforms was inactivated individually, and the requirement of each isoform for viral replication was analyzed in fibroblasts, endothelial cells, and macrophages. It has been shown that the largest E1 isoform (p87), but not the other E1 isoforms (p33, p36, and p38), are essential for MCMV replication in cell culture. Moreover, the presence of one of the two medium-sized E1 isoforms (p36 or p38) and the presence of intron 1, but not its specific sequence, are required for viral replication. By applying similar mutagenesis strategies to UL112/113, it was possible to compare the importance of individual E1 isoforms in both viruses. To further characterize the function(s) of the E1 proteins, potential cellular interaction partners for the essential large MCMV E1p87 isoform have been identified. To this end a SILAC-based approach using affinity purification and mass spectrometry was applied. Several proteins of the family of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP) were identified as potential interaction partners and further investigated.

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