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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78672
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7867/


New insights into the regulatory role of mRNA secondary structure in Escherichia coli through next-generation sequencing

Neue Einblicke in die regulative Rolle sekundärer mRNA-Strukturen in Escherichia coli durch Next-Generation Sequencing

Del Campo, Cristian

pdf-Format:
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Freie Schlagwörter (Englisch): Messenger RNA , RNA structure , protein translation , PARS , Escherichia coli
Basisklassifikation: 42.13 , 42.30 , 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Ignatova, Zoya (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.04.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 24.05.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Messenger RNA fungiert als Informationsmolekül zwischen DNA und translatierenden Ribosomen. Immer mehr Studien messen mRNA eine zentralere Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen bei. Auch wenn einzelne Beispiele zeigen, dass spezifische strukturelle
Eigenschaften der mRNA die Stabilität von Transkripten sowie die Translation regulieren, so sind die Rolle und Funktion für das gesamte bakterielle Transkriptom noch unerforscht.
Next-Generation Sequencing hat sich als bedeutende Methode herausgestellt, um Einblicke in die Regulation von zellulären Prozessen zu gewinnen. Auch wenn einige Schritte besonders im Hinblick auf die Analyse der Daten sorgfältig geprüft werden müssen, liefert die NGSTechnik neue Erkenntnisse bezüglich der transkriptionellen und translationellen Regulation
der Genexpression sowie über das Interaktom von Proteinen und Nukleinsäuren auf globaler Ebene.
Hier wurden drei Ansätze der Deep-Sequencing-Methode vereint und angewendet, um eine hochauflösende Sicht auf die mRNA-Sekundärstruktur, Translationseffizienz und mRNAHäufigkeit auf globalem Level zu gewinnen. Wir konnten zuvor unbekannte strukturelle Eigenschaften in der mRNA von E. coli entdecken, die Auswirkungen auf die Translation und Degradation von mRNA haben. Ein Sequenzbereich, der kaum Sekundärstrukturen aufweist und vor der eigentlichen gencodierenden Sequenz vorkommt fungiert als zusätzliche unspezifische Bindestelle von Ribosomen und erleichtert so die Initiation der Translation.
Trotz der intrinsischen Neigung sekundäre und tertiäre Interaktionen einzugehen, sind Sekundärstrukturen innerhalb von codierenden Sequenzen hochdynamisch und beeinflussen die Translation lediglich nur an wenigen Positionen. Eine Sekundärstruktur vor dem Stopcodon ist angereichert in Genen, die ein UAA als Stopcodon verwenden und spielt demnach wahrscheinlich für die Termination der Translation eine Rolle. Die Analyse auf globaler Ebene hat weiterhin eine allgemeine Erkennungssequenz der RNase E aufgedeckt, welche die endonukleolytische Spaltung initiiert. Somit wird in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal das „RNA-Strukturom“ von E. coli bestimmt, was den Einfluss der mRNA Struktur als direkten Effektor an einer Vielzahl von Prozessen wie Translation und mRNA Degradation hervorhebt.
Zusätzlich haben wir die Vor- und Nachteile neuer Technologien kritisch begutachtet, die auf NGS-Methoden basieren, um zum einen die RNA-Struktur aufzuklären und zum anderen translatierende Ribosomen zu detektieren, um einen nützlichen Leitfaden für die korrekte Wahl der entsprechenden Methode bezüglich der Anwendungsbedürfnisses und angesichts der Auflösung der Datenanalyse zu geben.
Kurzfassung auf Englisch: Messenger RNA acts as an information molecule between DNA and translating ribosomes. Emerging evidence places mRNA more centrally in various cellular processes. Although individual examples show that specific structural features of mRNA regulate translation and transcript stability, the role and function for the whole bacterial transcriptome remains unknown.
Next-generation sequencing emerged as a powerful tool to gain insights in regulation of cellular processes. Although with some pitfalls that need to be carefully assessed in data analysis, NGS-based techniques provided new insights in transcriptional and translational regulation of gene expression and protein-nucleic acid interactome on a global level. Combining three deep-sequencing approaches to provide a high resolution view of global mRNA secondary structure, translation efficiency and mRNA abundance, we unraveled unseen structural features in E. coli mRNA with implications in translation and mRNA degradation. A poorly structured site upstream of the coding sequence serves as an additional unspecific binding site of the ribosomes and facilitates initiation of translation. Despite intrinsically prone to establish secondary and tertiary interactions, secondary structures within coding sequences are highly dynamic and influence translation only within a very small subset of positions. A secondary structure upstream of the stop codon is enriched in genes terminated by UAA codon with likely implications in translation termination. The global analysis further substantiates a common recognition signature of RNase E to initiate
endonucleolytic cleavage. This work determines for the first time the E. coli RNA structurome, highlighting the contribution of mRNA secondary structure as a direct effector of a variety of processes, including translation and mRNA degradation.
Additionally, we critically review pros and cons of emerging new technologies, the NGSbased approaches to assess RNA structure and to profile translating ribosomes, in order to provide a useful guide for a correct choice of relative corresponding technique, in regards of the application needs and considering the resolution of each data analysis.

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