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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78740
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7874/


DiPPro-Nucleotide mit asymmetrischer Maskierung der Pyrophosphateinheit

DiPPro nucleotides with non-symmetric masking of the pyrophosphate unit

Weinschenk, Lina

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SWD-Schlagwörter: Pharmazeutische Chemie , Nucleosidanaloga , Biochemische Analyse
Freie Schlagwörter (Deutsch): Prodrugs , Pronucleotide , Medizinische Chemie , antivirale Wirkstoffe
Freie Schlagwörter (Englisch): prodrugs , pronucleotides , medicinal chemistry , antiviral agents
Basisklassifikation: 35.52
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meier, Chris (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.01.2016
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 12.05.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Analoga der natürlichen Nucleoside finden vielfach in der antiviralen und antitumor-Therapie Anwendung. Zur Behandlung von Infektionen mit Retroviren, wie HIV, werden sie als Reverse Transkriptase Inhibitoren eingesetzt. Da sie ihre Wirkung erst als Nucleosidtriphosphate entfalten, kann der zelleigene Metabolismus einen stark limitierenden Faktor für die Wirksamkeit dieser Substanzen darstellen. Aus diesem Grund wurden Pronucleotide entwickelt, die die ineffizienten Schritte umgehen, indem sie die hochpolaren Zwischenprodukte des Metabolismus am Wirkort freisetzen (Bypass). Ziel ist es hierbei, die Effizienz des Wirkstoffes zu erhöhen und mögliche Nebenwirkungen zu minimieren.
Das DiPPro-Konzept setzt Bis(acyloxybenzyl)-nucleosiddiphosphate ein, um den ersten und zweiten Schritt des Metabolismus zum Nucleosidtriphosphat zu umgehen. In vorangegangenen Studien konnte jedoch festgestellt werden, dass diese Verbindungen, sofern sie über eine ausreichende Lipophilie verfügen, beträchtliche Mengen an Nucleosidmonophosphat als Nebenprodukt freisetzen. Die NMP-Bildung resultiert aus dem Bruch der Phosphatanhydridbrücke, der als Konkurrenzreaktion zur Esterspaltung erfolgt. Mit wachsender Kettenlänge in der Estereinheit der Maske nimmt die Stabilität der Acylestergruppe zu, wodurch auch die Bildung von NMP zunimmt. Gleichzeitig werden jedoch lange Ketten in der Estereinheit benötigt, um eine für den Zellmembrandurchtritt ausreichend hohe Lipophilie zu erreichen. Die direkte Kopplung von Lipophilie und Stabilität, die bei den aliphatischen Bis(acyloxybenzyl)-nucleosiddiphosphaten mit zwei identischen Masken unumgänglich ist, wirkt sich somit negativ auf die Freisetzung von Nucleosiddiphosphat aus.

Das Ziel der Arbeit war die Entwicklung einer zweiten Generation von DiPPro-Pronucleotiden, die exklusiv das Nucleosiddiphosphat intrazellulär freisetzen sollen. Auf diesem Wege kann prinzipiell eine Effizienzsteigerung der Wirkstoffe erreicht werden. Die selektive Freisetzung von Nucleosiddiphosphat aus den Pronucleotiden setzt das Unterbinden der Nucleosidmonophosphat-liefernden Nebenreaktion voraus. Dies kann durch die Auflösung der gegenseitigen Abhängigkeit von Lipophilie und Stabilität erreicht werden.

In einem ersten Lösungsansatz wurden aromatische DiPPro-Nucleotide synthetisiert, bei denen Bis(benzoyloxybenzyl)-Einheiten zur Maskierung verwendet wurden, die in para-Position desaktivierende Substituenten tragen. Das Konzept wurde auf die anti-HIV-aktiven Nucleosidanaloga d4T und AZT angewendet und seine Effizienz in umfangreichen Hydrolysestudien und in antiviralen Tests geprüft. Die Untersuchung des Hydrolyseverhaltens dieser DiPPro-NDPs in Phosphatpuffer und CEM/0-Zellextrakten zeigte, dass die Pronucleotide das entsprechende NDP in hohem Maße freisetzten. Außerdem verfügten diese Pronucleotide über hohe antivirale Aktivitäten in HIV-infizierten Wildtypzellen. In den mutanten Thymidinkinase-defizienten Zellen war die anti-HIV-Aktivität der DiPPro-Nucleotide allerdings deutlich geringer.
In einem weiteren Lösungsansatz wurden asymmetrische DiPPro-d4TDPs und -AZTDPs entwickelt, die unterschiedliche Estereinheiten tragen – eine von geringer Stabilität und eine von hoher Lipophilie. Hierdurch wurde eine schnelle Hydrolyse zum einfach maskierten Intermediat erwirkt, aus dem die unerwünschte Freisetzung von NMP unwahrscheinlich ist.
Es konnte eine Vielzahl an DiPPro-d4TDP- sowie -AZTDP-Verbindungen mit unterschiedlichen Kombinationen von aliphatischen und aromatischen Acylestern isoliert werden, die in unterschiedlichen Medien bezüglich ihres Hydrolyseverhaltens untersucht wurden. Das Konzept wurde bestätigt: Bei hoher Stabilität gegenüber chemischer Hydrolyse setzten alle Verbindungen enzymatisch katalysiert sehr schnell über das einfach-maskierte Intermediat exklusiv das Nucleosiddiphosphat frei. Alle Pronucleotide zeigten sehr gute Aktivitäten gegen HIV in den Wildtypzellen, die teilweise sogar höher waren als die Aktivität der Stammnucleoside. Alle DiPPro-d4TDPs zeigten darüber hinaus auch in den Thymidinkinase-defizienten Zellen anti-HIV-Aktivität; die Aktivitäten der Verbindungen mit der höchsten Lipophilie blieben sogar vollständig erhalten. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass eine phosphorylierte Spezies – wahrscheinlich das Nucleosiddiphosphat – im Zellinneren freigesetzt und dort durch die entsprechenden Enzyme zum aktiven d4T-Triphosphat metabolisiert wird.

Diese Arbeit zeigt erstmals, dass es möglich ist, die dem DiPPro-Konzept zuvor inhärente Korrelation von Stabilität und Lipophilie aufzuheben. Durch die asymmetrische, bioreversible Maskierung der Nucleosiddiphosphate war es möglich, eine zweite Generation von DiPPro-Nucleotiden zu entwickeln, die als selektive NDP-Lieferanden fungieren. Dies kann potentiell zu einer enormen Effizienzsteigerung der Wirkstoffe führen und – besonders im Fall von AZT – eine drastische Minimierung von Nebenwirkungen nach sich ziehen.
Kurzfassung auf Englisch: Nucleoside analogs are widely applied as anti-tumor and anti-viral agents. As reverse transcriptase inhibitors they play an important role for the treatment of infections by retro viruses, like HIV. The active form being able to inhibit the reverse transcriptase is the nucleoside triphosphate. Therefore, the cellular metabolism often is a limiting factor for the efficiency of these compounds. Pronucleotides have been developed to bypass the inefficient steps by releasing highly polar intermediates of the metabolism at the target site. The main targets of these concepts are an increase of the efficiency of the agent and the avoidance of side effects.
The DiPPro concept applies bis(acyloxybenzyl) nucleoside diphosphates to bypass the first and the second step of the metabolism to the nucleoside triphosphate. However, it was found in previous studies that these compounds release considerable amounts of the nucleoside monophosphate as a byproduct, provided they have an adequate lipophilicity. The NMP-formation results from the breakage of the phosphate anhydride bridge, which occurs as a competing reaction to the ester cleavage. With increasing chain length in the ester moiety of the mask, the stability of the acyl ester group and therefore also the formation of NMP increased. Nevertheless, long chains are required in the ester moiety in order to achieve a sufficiently high lipophilicity for the passage of the cell membrane. In case of the aliphatic bis(acyloxybenzyl) nucleoside diphosphates with two identical masks the direct coupling of lipophilicity and stability is unavoidable. Therefore, the result is a lower amount of the formed nucleoside diphosphate.

The aim of this study was to develop a second generation of DiPPro pronucleotides that would exclusively release the nucleoside diphosphate intracellular. In this way an increase in efficiency of the active ingredients can be realized in principle. The selective release of nucleoside diphosphate from the pronucleotides presupposes the prevention of the nucleoside monophosphate-forming side reaction. This is achievable by avoidance of the correlation of lipophilicity and stability.

In a first approach aromatic DiPPro nucleotides were synthesized in which bis(benzoyloxybenzyl) units bearing deactivating substituents in the para-position were used for masking. The concept was applied to the anti-HIV agents d4T and AZT. Their efficiency was tested in extensive hydrolysis studies and in antiviral assays.
Hydrolysis studies of these pronucleotides in phosphate buffer and CEM/0 cell extracts proved the release of high amounts of the corresponding nucleoside diphosphate. All pronucleotides showed high antiviral activity in HIV-infected wild-type cells. However, a loss of viral activity was found in HIV-infected thymidine kinase-deficient cells.
In a second approach non-symmetric DiPPro nucleotides were developed bearing ester units of different stability or lipophilicity – one with low stability and one with high lipophilicity. This guarantees a fast hydrolysis to the mono-masked intermediate from which the release of unwanted nucleoside monophosphate is unlikely. d4T and AZT served again as nucleosides.
A range of non-symmetric DiPPro-d4TDP and DiPPro-AZTDP compounds bearing different combinations of aliphatic and aromatic acyl esters were isolated and studied in hydrolysis studies in different media. The designed NDP-delivery pathway was confirmed: After very fast enzymatic hydrolysis of all DiPPro compounds in the cell extracts to give the mono-masked intermediate with the lipophilic ester unit the exclusive product was the desired nucleoside diphosphate. On the other hand, the chemical stability was high. The measured antiviral activity of the DiPPro-NDPs against HIV confirmed these results. All pronucleotides were as active or even more active in wild-type cells than the corresponding parent nucleoside. Furthermore, for DiPPro-d4TDPs high activities were found in mutant thymidine kinase-deficient cells. Even the activities of highly lipophilic compounds were fully retained. These results demonstrate that a phosphorylated species – probably the nucleoside diphosphate – is released in the cell and is metabolized to the active d4T triphosphate.

In conclusion, this thesis proved the possibility to overcome the correlation of stability and lipophilicity, which was previously an inseparable part of the DiPPro concept. By non-symmetrical, bio-reversible masking of the nucleoside diphosphate, a second generation of DiPPro nucleotides was developed that act as a selective nucleoside diphosphate delivery system. This holds great potential of an increase in efficiency of the drugs and – particularly in the case of AZT – of a marked reduction of side effects.

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