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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78939
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7893/


Massenspektrometrische Charakterisierung von Proteinen aus Kondensaten der Pikosekunden-Infrarot-Laserablation

Mass Spectrometric Characterization of Proteins from condensates of the Picosecond Infrared Laser Ablation

Kwiatkowski, Marcel

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SWD-Schlagwörter: Massenspektrometrie , Infrarotlaser , Laserablation , Proteomanalyse
Freie Schlagwörter (Deutsch): Proteinspezies
Freie Schlagwörter (Englisch): Mass Spectrometry , IR-Laser , Laser Ablation , Proteomics , Protein Species
Basisklassifikation: 35.71 , 35.23 , 35.26
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.04.2016
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 26.05.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Proteinspezies sind als die kleinste Einheit des Proteoms definiert. Die Funktion einer Proteinspezies ist abhängig von ihrer exakten chemischen Zusammensetzung und bereits minimale Änderungen können eine Veränderung der Funktion bewirken. Für die Erforschung zellulärer, molekularer Mechanismen auf der Proteinebene ist es deshalb wichtig, Proteinspezies möglichst in ihrer in-vivo Form zu erfassen. Bei der Extraktion von Proteinen aus Geweben besteht die Gefahr, dass Proteinspezies durch enzymatische und chemische Reaktionen verändert werden. Die kalte Verdampfung von Geweben mit dem Pikosekunden-Infrarot-Laser (PIRL) ist ein sehr schonendes Verfahren zur Homogenisierung von Geweben. In der vorliegenden Arbeit wurde der Hypothese gefolgt, dass die chemische Zusammensetzung von Proteinspezies durch die PIRL-Ablation nicht verändert wird. Es konnte mit verschiedenen massenspektrometrischen Verfahren gezeigt werden, dass sich die chemische Zusammensetzung des Modellproteins RNase A sowie der Phosphoproteine Alpha-S1-, Alpha-S2 und Beta-Casein durch die PIRL-Ablation nicht verändert. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass sowohl Trypsin als auch Proteasen des humanen Blutplasmas nach der PIRL-Ablation enzymatisch aktiv waren, was gegen eine signifikante Denaturierung der Proteinspezies während der PIRL-Ablation spricht. Die Kondensate der Aerosole, die durch die Gewebeverdampfung mit dem PIRL gewonnen wurden, konnten ohne weitere Probenvorbereitung direkt auf die SDS-PAGE aufgetragen werden und die getrennten Proteine ließen sich sowohl massenspektrometrisch als auch mittels Western-Blot-Analyse nachweisen. Im Vergleich zur konventionellen Gewebehomogenisierung und Proteinextraktion konnte mit der PIRL-Ablation eine deutlich höhere Proteinausbeute erzielt werden. Die PIRL-Proteinextrakte humaner Tonsillen wiesen erheblich geringere Proteolyseprodukte und deutlich mehr Proteinspezies auf als die konventionell gewonnenen Proteinextrakte. Aus diesen Ergebnissen wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die PIRL-Ablation einen genaueren Blick auf die Proteinspezies-Zusammensetzung von Geweben in-vivo ermöglicht. Aufgrund der ultraschnellen und schonenden Verdampfung von Geweben sind intakte Proteinspezies bei der PIRL-Ablation enzymatischen Abbaureaktionen nur innerhalb eines äußerst kurzen Zeitraums ausgesetzt. Die explosionsartige, aber dennoch schonende Überführung von Geweben in Aerosole dürfte für die nahezu Partikel-freien Homogenate und damit für die hohen Proteinausbeuten sowie die hohe Anzahl von identifizierten Proteinspezies verantwortlich gewesen sein. In dieser Arbeit ist es gelungen, die Hypothese zu verifizieren, dass Proteinspezies intakt und mit hohen Ausbeuten aus Geweben gewonnen werden können, was die zukünftige Erforschung von Proteomen auf der Spezies-Ebene erleichtern sollte.
Kurzfassung auf Englisch: Protein species are defined as the smallest unit of the proteome. The function of a protein species depends on its exact chemical composition. Even small changes in its composition can change its function. For investigation of molecular mechanisms in cells on the protein level it is therefore important to detect protein species in their in-vivo state. During protein extraction from tissues there is a risk that the chemical compositions of protein species is changed by both enzymatic and chemical reactions. Cold tissue vaporization by the picosecond infrared laser (PIRL) represents a soft procedure for homogenizing tissue samples. Thus, this thesis was investigating the hypothesis that the chemical composition of protein species is not changed by PIRL ablation. It has been shown with different mass spectrometry methods that the chemical composition of RNase A as well as the chemical composition of the phosphoproteins alpha-S1-, alpha-S2- and beta-casein was not changed by PIRL ablation. In addition, trypsin as well as proteases in human blood plasma were still enzymatically active after PIRL ablation, which indicates that proteins are not significantly denatured during PIRL ablation. It was possible to load condensates from PIRL generated tissue aerosols directly on a SDS-PAGE and to detect the separated proteins by mass spectrometry and Western Blot analysis. The total protein yield was considerably higher using PIRL ablation for tissue homogenization and protein extraction compared to a conventional approach. Furthermore, PIRL derived protein extracts from human tonsils showed a substantially lower number of proteolysis products and a considerably higher number of protein species compared to conventional protein extracts. From these results, it was concluded that the PIRL ablation enables a closer look at the protein species composition of tissues in-vivo. Due to the ultrafast, cold and soft tissue vaporization, intact proteins are exposed to a significantly lesser extend to enzymatic degradation reactions through proteases and other enzymes. The explosive but gentle transformation of tissues into aerosols presumably is the reason for the generation of homogenates, which are almost free of particles and therefore responsible for the high protein yield and the high number of identified protein species. In summary, in this thesis confirmed the hypothesis that protein species are transferred intact from tissues into tissue homogenates via PIRL ablation. Thus, PIRL ablation in the future should make the investigation of proteomes on the species level more reliable with respect to their original in-vivo composition.

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