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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-79253
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7925/


Early cell interactions with magnesium-based materials

Zellereactionen auf die Magnesium-Materialien

Costantino, Maria Domenica

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Magnesium , Zytokine , Makrophagen , Osteoblasten , Biomaterials
Freie Schlagwörter (Englisch): Magnesium , Cytokines , Macrophages , Osteoblasts , Biomaterials
Basisklassifikation: 35.73
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Willumeit-Römer, Regine (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 09.08.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Magnesium (Mg) und Magnesiumlegierungen sind biologisch resorbierbare Materialien mit äußerst vorteilhaften mechanischen und physikalischen Eigenschaften für orthopädische Anwendungen. Der nächste Schritt für die Akzeptanz von Magnesiumwerkstoffen in der Medizin ist die Untersuchung des Einflusses der Abbauprodukte (Extrakte) auf Zellaktivitäten in dem umgebenden Gewebe. Nach der Implantation des Biomaterials reagiert das umgebende Gewebe gewöhnlich mit einer Entzündung auf das eingebrachte Material. Die Zellen des Immunsystems, allen voran die Makrophagen, setzten dabei Zytokinen frei und triggern so die Entzündungsreaktion. Diese Zytokinfreisetzung definiert die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen und damit sind die Makrophagen vorrangig verantwortlich für die finale Akzeptanz der Biomaterialien im Körper. Während des Abbauprozesses der Materialien wird eine hohe Konzentration von Mg freigesetzt. Mg2+ beeinflusst stark die Zellaktivität, wobei seine spezifische Rolle bei der Freisetzung von Zytokinen bisher unklar ist. Zentraler Punkt dieser Arbeit ist es daher, die Reaktion von Makrophagen auf die Abbauprodukte von Mg-Materialien zu erforschen. Zusätzlich wurde die spezifische Rolle von Mg2+ auf die Aktivität von Makrophagen untersucht. Hierfür wurden Zellen mit Mg-Salz in Form von MgCl2 stimuliert. Makrophagen wurden den Abbauprodukten von Mg, Mg-10Gd und Mg-2Ag in einer Reinkultur oder in einer Co-Kultur mit Osteoblasten ausgesetzt und analysiert. Für die Makrophagen in Reinkultur wurde ein in vitro Entzündungsmodell etabliert, beidem die Zellen einer Temperatur von 39°C ausgesetzt wurden. Das Modell wurde außerdem für die Untersuchung der Makrophagen reaktion auf verschiedene Mg2+ Konzentrationen verwendet. Die Zellereaktionen auf die Extrakte und MgCl2 wurde erforscht, indem wichtige Zytokine, die an der Verstärkung-bzw der Herunterregulation der Entzündungsreaktion und an der Zellrekrutierung beteiligt sind, analysiert wurden. Die Makrophagen in dieser Arbeit wurden aus im Blut zirkulierenden Monozyten gewonnen. Nach der Differenzierung zu Makrophagen, können zwei verschiedene Zellsubpopulationen entstehen. Diese werden allgemein als M1 und M2 bezeichnet. Der spezifische Einfluss der Extrakte auf die Makrophagen-Differenzierung und die Bildung von M1/M2 Subpopulationen wurde ebenfalls untersucht. Frisch isolierte Monozyten wurden während und nach der Differenzierung und der Bildung von M1/M2 -Subpopulationen verschiedenen Extrakten ausgesetzt. Ihr Einfluss auf die Zellen wurde anhand der Expression von Oberflächenmarker proteinen untersucht. Es konnte anhand des Entzündungs in vitro Modells gezeigt werden, dass Makrophagen, die mit und ohne Material-Extrakten kultiviert wurden, ihr natürliches Zellverhalten des aseptischen Entzündungszustandes beibehalten. Dieses Verhalten zeigt sich auch in Co-Kultur. In Kontakt mit Osteoblasten, regulieren Makrophagen die an der Verstärkung der Entzündungsreaktion beteiligten Zytokine herunter. Die getesteten Extrakte unterstützen dies, indem sie die Freisetzung von Targetmolekülen, die am Knochenumbau beteiligt sind, induzieren. Sowohl in der Mono-Kultur als auch in der Co-Kulturkonnte gezeigt werden, dass die jeweilige Extrakt zusammensetzung von Mg-10Gd und Mg-2Ag die Zytokin-Freisetzung unterschiedlich beeinflusst. In Versuchen mit frisch aus dem Blut gewonnenen Monozyten konnte gezeigt werden, dass Mg-2Ag Extrakte bei der M2Makrophagen Polarisation eine Rolle spielen. Experimente, die mit verschiedenen Konzentrationen von MgCl2 durchgeführt wurden, ergaben, dass der Einfluss der Mg2+ Ionen auf die Freisetzung von Zytokinen zeitabhängig ist. Die vorliegende Arbeit beleuchtet die bioaktiven Eigenschaften von Mg-Materialien auf molekularer Zellebene und die Ergebnisse legen nahe, dass diese die Entzündung nach der Implantation des Materials in den Körper günstig beeinflussen und einen chronischen Verlauf verhindern kann.
Kurzfassung auf Englisch: Magnesium (Mg) and its alloys are biodegradable materials with known advantageous mechanical and physical properties for orthopaedic applications. The influence of degrading products (extracts) on cell activity is the next step to be considered for the acceptance of magnesium-based materials in medical applications. After implantation of a biomaterial, the cells of the immune system promote an inflammatory reaction in the tissue that surrounds the implant material. Macrophages are the principal cell players, and their capacity to release cytokines defines the cross-talk between different cell types and finally the acceptance of the biomaterials by the body. During the biodegradation process, the materials release high concentrations of Mg. This element, in its ion form (Mg2+), strongly influences the cells’ activities but its specific role in cytokine release from macrophages is yet unclear. The central point of this work is to explore the response of macrophages to degradation products of Mg-based material. Besides, the specific effect of Mg2+ on macrophage activity was investigated by stimulating the cells with Mg salt in the form of MgCl2. Macrophages were exposed to the degradation products of pure Mg, Mg-10Gd and Mg2Ag, both alone and in co-culture with osteoblasts. For the macrophage monoculture, an inflammatory in vitro model was established exposing the cells to a temperature of 39°C. This model was also used for the evaluation of macrophage behaviour in different Mg2+ concentrations. The cells’ response to the extracts and MgCl2 were explored by analysing the key cytokines involved in the key steps of the inflammatory reaction. Macrophages in this study are derived from circulating monocytes in blood. After differentiation into macrophages, two different subpopulations can be distinguished. These cell populations are broadly classified as M1 and M2 macrophages. The specific influences of the extracts on macrophage differentiation and M1/M2 formation were investigated as well. Freshly isolated monocytes were exposed to the extracts during and after differentiation and the formation of M1/M2 populations. The cells were analysed for surface marker protein expression. Results obtained in the inflammatory in vitro model show that macrophages cultured with and without material extracts preserve the cells’ natural behaviour in aseptic inflammatory conditions. Such a response was also evident in the coculture. When in contact with osteoblasts, macrophages down-regulate cytokines involved in the amplification of the inflammatory reaction. The extracts tested promoted this, inducing the release of target molecules involved in bone remodelling. It could be shown in both, mono and co-culture conditions that the total extract compositions of Mg-10Gd and Mg-2Ag influenced cytokine release via different pathways. The results obtained with fresh monocytes indicate that Mg-2Ag extracts play a role in M2 macrophage polarization. Experiments performed with different concentrations of MgCl2 showed that Mg2+ influences the release of cytokines in a time-dependent manner. The work presented here demonstrates the bioactivity property of Mg-based materials at molecular level and that such influence prevents chronic inflammatory events after implantation of this kind of material in the body.

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