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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-79628
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7962/


Characterization of the protein export steps at the parasite-host cell interface of the human malaria parasite Plasmodium falciparum (Welch, 1897)

Characterisierung der Proteinexportschritte an der Parasitenperipherie des menschlichen Malariaerregers Plasmodium falciparum (Welch, 1897)

Mésen-Ramírez, Paolo

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Malaria, Proteinexport, Translokation, Entfaltung, PTEX
Freie Schlagwörter (Englisch): Malaria, Protein export, Translocation, Unfolding, PTEX
Basisklassifikation: 42.15 , 42.36 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Burmester, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.06.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 15.07.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Plasmodium falciparum ist ein intrazellulärer Parasit, der die tödlichste Form der menschlichen Malaria verursacht. Die ungeschlechtlichen Blutstadien des Malariaerregers entwickeln sich innerhalb der roten Blutzellen (RBC) in einer parasitären Vakuole (PV), die von der PV-Membran (PVM) umgeben ist. Um innerhalb dieser einzigartigen Nische zu überleben, muss der Parasit ein großes Repertoire an Proteinen in seine Wirtszelle exportieren, um Nährstoffaufnahme, Zytoadhärenz und Immunevasion zu gewährleisten.

Verschiedene Arten von exportierten Proteinen mit unterschiedlichen subzellulären Lokalisierungen wurden in Malaria-Parasiten identifiziert. Alle exportierten Proteine scheinen zumindest teilweise einen gemeinsamen Exportweg zu haben. Transportierte Proteine müssen die PVM überwinden, um ihren endgültigen Bestimmungsort in der RBC zu erreichen. Dieser Schritt wird möglicherweise durch einen Proteinkomplex in der PVM, Plasmodium Translokon von PEXEL-Proteinen (PTEX) genannt, vermittelt. Dieser Komplex entfaltet die zu translozierenden Polypeptide für den Transport über die PVM. Allerdings gibt es bisher noch keinen Beweis, dass dieser Komplex wirklich Translokationsaktivität hat und die Identität des Kanals, durch den die Polypeptide in die Wirtszelle transportiert werden, ist unklar. Im Vergleich zu löslichen Proteinen ist der Exportweg für die Membranproteine noch rätselhaft. Die Abfolge der Translokationsereignisse zwischen der PPM und der PVM ist zurzeit unklar und schwer zu erfassen und die einzelnen Translokationsschritte sind noch nicht nachgewiesen worden.

Um diese Fragen zu klären, wurden in dieser Dissertation Fusionsproteine erzeugt, die eine redox –sensitive, faltbare Domäne, BPTI genannt, enthalten. Fusioniert mit einem exportierten Protein faltet sich die Domäne nur unter den oxidierenden Umständen der parasitären Vakuole. Die Versuche mit diesen Fusionsproteinen zeigten, dass integrale Membranproteine zwei von der Entfaltung abhängige Schritte benötigen, um die Wirtszelle zu erreichen. Diese Proteine werden erst aus der PPM extrahiert (1. Schritt) und in die PV freigelassen, wo sie durch einen mit löslichen Proteinen gemeinsamen Schritt über die PVM transloziert werden (2. Schritt). Dieser Mechanismus ist abhängig von der Länge der Region zwischen der TM Domäne und dem C-terminal fusionierten BPTI (Spacer genannt). Bei Proteinen mit einem langen Spacer scheinen die Translokationsschritte in der PPM und PVM gekoppelt zu sein, während Proteine mit kurzem Spacer zwischenzeitlich in die PV freigelassen werden.

Um konditionell den Export eines Proteins an der PVM oder der PPM zu blockieren, wurden Fusionsproteine hergestellt, die eine induzierbare, faltbare Domäne namens mDHFR enthalten. Die Fusionsdomäne wird hierbei an der Entfaltung gehindert, was die Translokation des mit der Domäne verbundenen exportierten Proteins an der Parasitenperipherie blockiert. Aus diesen Daten wurde geschlossen, dass alle Klassen der exportierten Proteine entfaltet werden müssen, um in die rote Blutzelle zu gelangen und Translokation ein gemeinsamer Mechanismus für den Export aller Klassen von Proteinen ist.

Zudem verhielten sich die untersuchten mDHFR Fusionsproteine wie stabile Translokationssubstrate, die während der Translokation aufgehalten werden. Dies verstopfte die Translokons an der PVM und führte zu einer globalen Exportblockade aller Arten von exportierten Proteinen an der Parasitenperipherie, ein Effekt, der hier ´Co-block genannt wird.. Dies zeigte erstens, dass alle Proteinklassen beim Transport in die Wirtszelle beim Exportschritt über die PVM am gleichen Typ Kanal konvergieren. Zweitens konnte dadurch die Wichtigkeit des Protein-Exports für die Entwicklung des Parasiten gezeigt werden, da eine globale Exportblockade die Parasitenentwicklung hemmte.

Darüber hinaus wurde die Funktion von EXP2, einer PTEX-Komponente, die als die Membran-durchspannende Pore in der PVM angenommen wird, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Substrate, die in dem Translokon in der PVM stecken geblieben waren, in einem Komplex mit EXP2 sind. Dies liefert einen Hinweis darauf, dass EXP2 Teil des Protein-leitenden Kanals sein könnte, durch den die Proteine in die infizierte RBC exportiert werden. Dies unterstützt eine Verbindung zwischen Translokationsaktivität und dieser PTEX-Komponente.

Zusammengefasst ermöglichten konditionell faltbare Domänen, die Transportprozesse durch die Membranen in der Parasitenperipherie bei P. falciparum zu untersuchen. Diese Studie liefert Einblicke in eine Reihe von Transportereignissen, die sich an der Parasiten-Wirtszellen-Grenze bei den verschiedenen Arten von exportierten Proteinen abspielen und beschreibt überschneidende Translokationswege für alle Klassen von exportierten Proteinen, einschließlich löslicher Proteine und integraler Transmembranproteine.

Kurzfassung auf Englisch: Malaria parasites develop within red blood cells (RBC) in a compartment termed parasitophorous vacuole (PV) surrounded by the PV membrane (PVM). To survive within this unique niche the parasites export a large repertoire of proteins into their host cell. These proteins are involved in nutrient uptake, cytoadherence and immune evasion. Protein export is hence crucial for the survival and virulence of intracellular P. falciparum blood stage parasites.

Different types of soluble and TM exported proteins with diverse localizations in the RBC have been identified in malaria parasites. All types of exported proteins need to cross the PVM to reach their final destination in the RBC and this step is dependent on unfolding and translocation by a protein complex at the PVM termed Plasmodium translocon of PEXEL proteins (PTEX). However, up to now there is no demonstration of direct translocation by this complex and the identity of the protein-conducting channel through which polypeptides are threaded into the host cell remains unknown. It is also intriguing how the same type of protein translocons at the PVM mediates the passage of proteins with different export signals and structures. In contrast to soluble proteins, the export pathway for TM proteins is even more enigmatic. The succession of translocation events between the parasite plasma membrane (PPM) and the PVM for these proteins is still elusive and the individual translocation steps have not been demonstrated yet.
To address these questions, a conditional redox sensitive foldable domain termed BPTI was exploited in the present work to gain insights into the export of TM proteins beyond the PPM. Fused to exported proteins, this domain will become folded only in the oxidizing conditions of the PV. Using these constructs it was demonstrated that TM proteins require two unfolding dependent translocation steps to reach the host cell: they are first extracted out of the PPM, released transiently into the PV and further translocated at the PVM in an export step shared with soluble proteins. Depending on the length of the region between the TM domain and the C-terminally fused BPTI (spacer), these steps occurred in a different fashion, suggesting that in proteins with long spacers PPM and PVM translocation may be coupled whereas proteins with short spacers are transiently released into the PV before translocation at the PVM.
Moreover, fusion proteins containing a foldable domain named mDHFR were generated in this PhD thesis. This made possible to conditionally block export at the PVM or PPM by ligand-induced prevention of unfolding of the fusion domain and this was used to dissect the trafficking events that exported proteins undergo in the parasite periphery. The corresponding fusion proteins revealed that all classes of exported proteins are dependent on unfolding to be exported and hence, translocation is a common mechanism of export in malaria parasites.
Among the newly generated mDHFR fusion proteins several showed a behavior differing from previously published constructs. These fusion proteins remained stably arrested in the translocon when their unfolding was prevented and this hampered the export of all other classes of exported proteins. This indicated that these constructs jammed a common type of translocons at the PVM, an effect that was in this thesis termed a 'co-block'. This indicated that all classes of exported proteins cross the PVM through a common type of protein-conducting channels to reach the host erythrocyte. Prompted by these results, these intermediates were also exploited to generate a global block of protein export which led to an arrest of parasite growth, demonstrating that protein export is essential for parasite development in the RBC.

Furthermore, taking advantage of the stable translocation intermediates, the function of EXP2, the PTEX component proposed to be the membrane spanning pore at the PVM, was investigated using co-immunoprecipitation assays. These experiments revealed that substrates stuck in translocation, but not PPM arrested proteins, are in a complex with EXP2 at the PVM but not with the PTEX component HSP101. This provides evidence that EXP2 may be the protein- conducting channel through which exported proteins are delivered into the infected RBC. This supports a link between translocation activity and the PTEX component.
Taken together conditionally foldable domains enabled to investigate the transport processes across membranes at the parasite periphery in P. falciparum parasites. This study provides mechanistical insights into the series of trafficking events that take place at the parasite host-cell interface and reveals overlapping translocation steps for the different types of exported proteins.

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