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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-79705
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/7970/


Metal Ion Based Probes for Imaging

Metallionen basierte Sonden für die Bildgebung

Besztejan, Stephanie

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SWD-Schlagwörter: Aequorin , Durchstrahlungselektronenmikroskopie , Nanopartikel
Freie Schlagwörter (Deutsch): Protein Design
Freie Schlagwörter (Englisch): in-liquid TEM , gold nanoparticle , protein design , aequorin
Basisklassifikation: 35.74
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Rentmeister, Andrea (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.06.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 09.08.2016
Kurzfassung auf Englisch: In the framework of this thesis, metal ions were used for two different approaches for the
application as bimodal probes for light and electron microscopy.
Gold nanoparticles (AuNPs) were used in the first strategy to establish in-liquid TEM. The
AuNPs were used to image DNA-hybridization. Moreover, mammalian cells were imaged using in-liquid TEM. Subcellular structures such as nucleus, nucleoli, and cell membranes were visible without additional staining or sample preparation. It was also possible to perform live cell imaging of prostate cancer cells (PC3 and LNCaP) using in-liquid TEM. Dynamics of subcellular structures could be observed. Ribonucleotide-functionalized AuNPs were also used for live cell imaging.
The second approach used Sm3+ ions and the enzyme aequorin (AQ). AQ was engineered towards a bimodal probe for light and electron microscopy. The enzyme emits light upon metal ion binding. The natural metal ion inducing luminescence is Ca2+. The engineering yielded a new variant TS A123W S125E that had 40-fold improved affinity for Sm3+ compared to the parental thermostabilized AQ TS. The Ca2+ affinity decreased 30-fold. Binding of Sm3+ of the new variant TS A123W S125E could induce contrast in conventional TEM analysis. Additionally it showed luminescence in cell tests with PC3 cells for both Sm3+ and Ca2+.
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Strategien für die Anwendung von Metallionen als Sonden für die Mikroskopie beschrieben. Der erste Teil handelt von der Etablierung der In-liquid TEM-Technologie. Es wurden DNA-umhüllte Gold Nanopartikel (AuNPs) verwendet. Die AuNPs gaben den Kontrast für die Elektronenmikroskopie, während die DNA genutzt wurde um Multimere über DNA-Hybridisierung zu realisieren. Als Multimere wurden nur Gebilde aus mindestens 3 AuNPs gewertet, die unterschiedlicher Größenzusammensetzung waren. Die Hybridisierung wurde in vitro durchgeführt und die Proben nachfolgend mittels in-liquid TEM analysiert. Nur in der Probe mit allen nötigen Bestandteilen für die Hybridisierung konnten Multimere in den speziell angefertigten Siliziumnitrit nanofluidischen Zellen detektiert werden. Auf Basis der guten Robustheit der DNA aus den Vorexperimenten wurden mammalische Prostatakarzinomzellen der Linie PC3 auf die Siliziumnitritflächen gesät, fixiert und ohne weitere Probenbehandlung, wie sonst für Elektronenmikroskopie üblich, mittels in-liquid TEM analysiert. Hier waren subzelluläre Strukturen wie Nukleus, Nukleoli und distinkte Membranen sichtbar. Der natürliche Kontrast konnte auf z-Kontrast durch das Element Phosphor zurückgeführt werden, das sich in der DNA/RNA und in den Membranen angereichert in den Biomolekülen befindet. Auch lebende nicht fixierte PC3 Zellen untersucht. Diese zeigten ebenfalls die bereits beschriebenen subzellulären Strukturen.
Der zweite Teil der Arbeit handelt von der Konstruktion einer Aequorin (AQ)-variante basierend auf einer thermostabilisierten Variante (AQ TS) für verbesserte Sm3+-Affinität zum Einsatz als bimodale Sonde für Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie.
Zwei verschiedene Herangehensweisen wurden durchgeführt. Auf der einen Seite wurde Sättigungsmutagenese an den einzelnen sechs beteiligten Aminosäure-Positionen für die Metallionenkoordination des konservierten EF-Hand-Motivs 2 von AQ TS durchgeführt. Auf der anderen Seite wurde ein rationaler Ansatz basierend auf Lanthanoid-bindenden-tags (LBT) durchgeführt. Dieser Ansatz fokussierte sich auf Position 7 und 9 des EF-Hand Motivs. Für EF-Hand 2 des AQ TS wurden die Substitutionen TS A123W S125E adaptiert.Die beste aller getesteten Varianten war TS A123W S125E mit einer 40-fach erhöhten Affinität zu Sm3+ und gleichzeitiger Verringerung der Ca2+-Affinität um Faktor 30. Außerdem zeigte TS A123W S125E strukturelle Veränderungen im Vergleich zu AQ TS. Diese verbesserte Variante TS A123W S125E wurde daraufhin auf ihre beabsichtigte kontrastgebende Eigenschaft für die Elektronenmikroskopie getestet. Die neue Variante konnte durch das gebundene Sm3+ Kontrast im TEM erzeugen. Das Ziel eine verbesserte AQ-Variante zu konstruieren, die kontrastgebend in der Elektronenmikroskopie ist und für die Lichtmikroskopie verwendet werden kann, wurde mit der neuen Variante TS A123W S125E realisiert.

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