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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-80104
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8010/


Design, Synthese und Analyse von Inhibitoren der humanen Galactosyltransferase B (GTB)

Leccese, Patrizia

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Sättigungstransferdifferenz NMR , NMR basierter Enzymassay , Progresskurvenanalyse, SPR, Strukturbasiertes Wirkstoffdesign, Molekular Modelling
Freie Schlagwörter (Englisch): structure based design , NMR based enzyme assay, saturation transfer difference NMR , progress curve analysis, molecular modelling
Basisklassifikation: 35.00 , 35.39
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.06.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 29.07.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Glycokonjugate üben diverse, essentielle Funktionen bei unterschiedlichen biologischen Vorgängen aus. Sie sind unter anderem bei der Zellerkennung und in Signaltransduktionskaskaden involviert. Bei pathologischen Veränderungen, wie beispielsweise der Entstehung von Krebs, können veränderte Glycanstrukturen nachgewiesen werden. Ihre Analyse trägt dazu bei zelluläre und physiologische Prozesse zu verstehen und im Falle pathologischer Veränderungen in einem therapeutischen Sinne beeinflussen zu können.
Der Aufbau von Glycokonjugaten erfolgt durch eine spezielle Klasse von Enzymen: den Glycosyltransferasen (GT). Ein wichtiger Kontrollmechanismus zum besseren Verständnis der biologischen Vorgänge ist die spezifische Hemmung von Glycosyltransferasen.
Die Entwicklung und die Darstellung von selektiven und spezifischen Inhibitoren steckt heute noch in den Kinderschuhen, da zum einen die enzymatisch katalysierten Reaktionen äußerst komplex sind und die Glycosyltransferasen als Transmembranproteine schwer zugänglich sind. Aber auch der synthetische Zugang zu derartigen Strukturen ist sehr schwierig und kostenintensiv.
Im Rahmen dieser Arbeit diente die humane Galactosyltransferase B (GTB) als Modellsystem zur Entwicklung verschiedener Inhibitoren. Sie bietet sich als Modellsystem an, da die dreidimensionale Struktur durch die Lösung mehrerer Kristallstrukturen aufgeklärt werden konnte. Zudem lieferten mechanistische Studien erste Erkenntnisse über die Wirkungsweise des Enzyms.
GTB katalysiert den finalen Schritt zur Bildung des Blutgruppenantigens B. Dabei findet die Übertragung einer Galactoseeinheit vom Donorsubstrat UDP-α-D-Galactose (UDP-Gal) auf die O-3-Position der terminalen Galactose des Akzeptorsubstrates, dem H-Antigen statt.
Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Der erste Teil befasst sich mit der Entwicklung und dem strukturbasierten Design, sowie der synthetischen Darstellung von bisubstratbasierten Inhibitoren der GTB. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Synthese und Analyse von nicht-substratbasierten Inhibitoren der GTB.
In einer früheren Arbeit wurde das Disaccharidmimetikum 18 mittels molecular modelling entwickelt. 18 stellt einen potentiellen Inhibitor der GTB dar. Das Disaccharidmimetikum setzt sich aus zwei Motiven zusammen. Das Akzeptormotiv besteht aus einem L-Fucosebaustein, der über einen Pentyllinker mit einem Teil des Donormotivs verknüpft ist. Das Donormotiv besteht aus einem D-Galactosebaustein. Durch die Verbindung des Akzeptormotivs mit dem Donormotiv verspricht dieser Ligand größtmögliche Spezifität sowie Selektivität, da in ihm die Strukturelemente des Akzeptorsubstrates und des Donorsubstrats miteinander vereint sind. Aufbauend auf diese Struktur wurden weitere Inhibitoren in silico entwickelt und mittels molecular modelling auf ihre Bindungseigenschaften hin untersucht.
Die in silico entwickelten Bisubstratanaloga dienten nachfolgend als Vorlage für zu synthetisierende Disaccharidmimetika. Das Disaccharidmimetikum 28 wurde ausgewählt und es wurde eine Synthesestrategie entworfen. Diese sah die Verwendung mehrerer Bausteine vor. Ausgehend von Ligand 28 konnte Ligand 39 entwickelt werden, der noch einen großen Teil des Akzeptors abdecken soll. Für 39 wurde ebenfalls eine Synthesestrategie entworfen und optimiert. 28 und 39 konnten nach Optimierung und Verifizierung erfolgreich dargestellt werden. Beide stellen potentielle Inhibitoren der GTB dar.
Der zweite Teil der Arbeit umfasst die synthetische Darstellung und Ermittlung der Bindungseigenschaften von nicht-substratbasierten Inhibitoren der GTB. Diese wurden von Felix Niemeyer (F. Niemeyer, unveröffentlichte Ergebnisse) durch Docking-Studien als erfolgversprechende Kandidaten zur Inhibierung der GTB ermittelt. Die ermittelten Strukturen leiten sich von dem bereits bekannten Inhibitor 16 einem Phenylpiperazinothiadiazol (Ligand 382) der GTB ab.
Vier dieser Kandidaten (54, 55, 56, 57), die am Piperazin mit verschiedenen Resten amidiert sind wurden erfolgreich synthetisiert und anschließend auf ihr inhibitorisches Potential hin untersucht. Die Bindungseigenschaften von 54, 55 und 56 gegenüber GTB wurden durch SPR-Bindungsstudien ermittelt. Ligand 54 zeigte in dem untersuchten Konzentrationsbereich keine Wechselwirkung mit GTB. Die kinetisch ermittelten Dissoziationskonstanten für die Verbindungen 55 und 56 liegen im niedrig mikromolaren Bereich. Das inhibitorische Potential von 55, 56 und 57 gegenüber GTB konnte durch kompetitive STD-NMR-Experimente und Progresskurvenanalyse bestätigt werden. Die ermittelten KI-Werte liegen im niedrig mikromolaren Bereich und bestätigen damit die kinetisch-bestimmten KD-Werte der SPR-Bindungsstudien. Für Verbindung 57 konnte zusätzlich durch Progresskurvenanalyse ein KI-Wert von 41.5 μM bestimmt werden. Damit zählt 57 zu den stärksten momentan bekannten Inhibitoren der GTB.
Kurzfassung auf Englisch: Glycoconjugates play a key role in various biological processes e.g. cell recognition and signal transduction cascades. Furthermore, they are involved in pathological processes such as oncogenesis. Hence there is a great interest in their analysis to further understand their biological role. Especially because of their involvement in cellular and physiological processes it is important to include glycans as targets in therapeutic approaches.
The synthesis of glycoconjugates is carried out by a special class of enzymes: glycosyltransferases (GT). The specific inhibition of glycosyltransferases is an important control mechanism to understand biological processes. Considering the complexity of the enzymatic reactions it is still challenging to find suitable inhibitors. Furthermore the synthesis of inhibitors is very difficult and expensive.
In this work the human blood group B galactosyltransferase (GTB) served as a model system for the development of various inhibitors. GTB catalyzes the transfer of a galactose unit from UDP-galactose to the H-antigen forming the blood group B-antigen. The crystal structure of GTB revealed the bioactive conformation of the donor and the location of the acceptor substrate and further elucidates the mechanism of the binding event.
This thesis is divided into two parts. The first part describes the structure based approach of the design and synthesis of new bisubstrate inhibitors for GTB. The second part deals with the synthesis and the binding analysis of non-substrate based inhibitors of GTB. This is a class of alternative inhibitor chemotypes that are not structurally derived from GT donors or acceptors. The identified structures are derivates from the known inhibitor 16 (compound 382) a piperazinyl phenyl thiadiazole.
In earlier work ligand 18 was designed in silico. This molecule was used as a lead structure for disaccharide mimics. The selected disaccharide mimics combine both requirements of bisubstrate analoges: selectivity and specifity. The selected molecules have a covalent linkage between the donor motive and the acceptor motive. The disaccharide mimic 28 was selected and a synthetic strategy consisting of two building blocks was developed. Another ligand 39 that should cover the acceptor site better was designed based on the structure of the ligand 28. Also for 39 a synthetic strategy was developed and optimized. After optimization and verification 28 and 39 were successfully synthesized. Both are potential inhibitors of GTB.
The second part of this work focuses on the synthesis and analysis of binding affinity of non-substrate based inhibitors of GTB. They were found by Felix Niemeyer (Niemeyer, F. unpublished work) by docking studies. The non-substrate based inhibitors that are modified by amidation of the piperazinyl group are derivatives of a known inhibitor 16 of GTB. Four candidates were selected.
The compounds 54, 55, 56 and 57 were synthesized and subsequently analyzed with a focus on the inhibitory potential of GTB. The binding affinity of 54, 55, 56 was determined by surface plasmon resonance experiments (SPR).
Ligand 54 exhibits no competitive behavior in the analyzed concentration range. The kinetically determined dissociation constants of 55 and 56 were consistently in the low micromolar range.
The inhibitory potential of 55, 56 and 57 was determined by competitive saturation transfer difference (STD) NMR experiments and progress curve analysis. The resulting KI values are in low micromolar range. The results confirm the kinetically determined KD values of the SPR experiments. In addition for ligand 57 a KI value of 41.5 μM was determined by progress curve analysis. Thus, 57 is currently the strongest known inhibitor of GTB without changes.

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