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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-80766
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8076/


The role of the cell adhesion molecule CHL1 and its interaction partners in cerebellar development

Die Bedeutung des Zelladhäsionsmoleküls CHL1 und seiner Interaktionspartner in der Entwicklung des Kleinhirns

Katic, Jelena

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Freie Schlagwörter (Englisch): Neuroscience , development , adhesion molecules , cerebellum
Basisklassifikation: 42.61 , 42.63 , 42.23 , 42.25 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.08.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 09.09.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Zelladhäsionsmoleküle der Immunglobulin-Superfamilie spielen eine wichtige Rolle während der Entwicklung des Nervensystems und werden in gut organisierten temporospatialen Muster exprimiert. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Kleinhirns und der Bildung synaptischer Kontakte. Ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie und enger Verwandter des Zelladhäsionsmoleküls L1, ist das Zelladhäsionsmolekül CHL1 (close homologue of L1), welches in vielen verschiedenen Zellen während der Entwicklung und im adulten Kleinhirn exprimiert wird. Da CHL1 eine wichtige Funktion beim Aufbau und der Ausbildung der Architektur des Kleinhirns in Mäusen übernimmt, wirkt sich die Entfernung von CHL1 störend auf die Gehirnentwicklung aus. Die Axone der Sternzellen und Dendriten der Purkinje-Zellen CHL1-defizienter Mäuse weisen ein abnormales Verzweigungsmuster und eine reduzierte Synapsen-Bildung auf, was zu einer progressiven Atrophie der Axonendigungen und nachfolgend zum Absterben von Purkinje-Zellen wärend der ersten postnatalen Woche führt. Außerdem scheint die Zellmigration der Körnerzellen von sieben Tage alten CHL1-defizienten Mäusen beeinträchtigt zu sein, was eine Akkumulation der Zellen in der Molekularschicht zur Folge hat. Das signifikante Absterben der Purkinje-Zellen in adulten CHL1-defizienten Mäusen wird als Konsequenz der Ablation von CHL1 während der Entwicklung des Kleinhirns gesehen. Aus diesem Grund ist es von großem Interesse neue Interaktionspartner von CHL1 zu finden und die Mechanismen, welche bei der Entwicklung von Körnerzellen und Purkinje- Zellen eine Rolle spielen, zu erforschen. In vorausgegangenen biochemischen cross-linking Experimenten konnte das Transmembranprotein Vitronektin als neuartiger Bindungspartner von CHL1 identifiziert werden. Weiterhin wurden der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (plasminogen activator inhibitor-2; PAI-2) und der Hedgehog Rezeptor patched mit Hilfe von phage-display als Interaktionspartner ermittelt. In meiner Arbeit konnte ich die direkte Interaktion von CHL1 mit Vitronektin, PAI-2 und patched mittels Ko-Immunopräzipitation, im Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Label Free Binding Assay verifizieren. Durch immunhistologische Experimente und Proximity Ligation Assay (PLA) an histologischen Schnitten von frühem postnatalen Kleinhirngewebe konnte die Ko-Lokalisation mit diesen Proteinen bestätigt werden. Ich konnte zeigen, dass Vitronektin und PAI-2 an den extrazellulären Teil von CHL1 binden und dass CHL1 durch Interaktion mit Vitronektin und PAI-2 das Neuritenwachstum und die Zellmigration von kultivierten Kleinhirnneuronen induziert. Darüber hinaus reduziert die Applikation eines PAI-2 abgeleiteten Peptids und von Antikörpern welche an Vitronektin, PAI-2, Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA) oder uPA Rezeptor die Migration von Kleinhirnneuronen. Interessanterweise führt die Interaktion von Vitronektin mit CHL1 zu einer reduzierten Proliferation und verzögerten Differenzierung von Vorläuferzellen der Körnerzellen, wobei die radiale Migration der Körnerzellen zwei Tage später durch diese Interaktion erhöht wird. Zudem konnte in Kulturen von Kleinhirnneuronen gezeigt werden, dass die trans-Interaktion von CHL1 und patched sowohl die Neuritogenese als auch die Migration und das Überleben von Körnerzellen begünstigt. Die Bindung von CHL1 an die erste extrazelluläre Schleife von patched erfolgt durch eine extrazelluläre Aminosäuresequenz in CHL1 die einer Aminosäuresequenz von sonic hedgehog sehr stark ähnelt. Patched - oder von CHL1- abgeleitete Peptide, patched Antikörper, der smoothened Inhibitor SANT-1 sowie von RhoAoder ROCK-Inhibitoren reduzieren die CHL1-vermittelte Neuritogenese, Migration sowie das
Überleben von dissoziierten Körnerzellen in Kultur. In organotypischen Kulturen von Kleinhirnneuronen wird das CHL1-induzierte Zellüberleben von Körnerzellen und Purkinje- Zellen durch Zugabe von Inhibitoren gegen smoothened, RhoA und ROCK reduziert. Histologische Untersuchungen von 10 und 14 Tage alten CHL1-deffizienten Mäusen zeigten eine erhöhte Apoptose von Körnerzellen der internen Körnerzellschicht, jedoch konnte keine vermehrte Apoptose bei Purkinje-Zellen festgestellt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine regulatorische Funktion von CHL1 bei der Apoptose von Körnerzellen während der zweiten postnatalen Woche hin. In dieser Forschungsstudie wurden neue Bindungspartner von CHL1 sowie Signalwege, die bei der Morphogenese während der postnatalen Entwicklung des Kleinhirns mitwirken, identifiziert und charakterisiert. Zudem konnte ich zeigen, dass die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen der Körnerzellen durch CHL1 reguliert werden. Die Bindung von CHL1 mit Vitronektin, PAI-2 und patched führt zu einer vermehrten Neuritogenese und Migration von Körnerzellen während der ersten postnatalen Woche. Außerdem führt die Abwesenheit von CHL1 zu einer verzögerten Migration von Körnerzellen und deren Akkumulation in der Molekularzellschicht. Weiterhin werden RhoA und die RhoAassoziierte Kinase durch patched und smoothend anhängige Signalübertragungswege aktiviert. Durch das Einleiten dieser Signalwege wird das Zellüberleben in der zweiten postnatalen Woche gesteuert. In adulten CHL1-defizienten Mäusen induziert die Abwesenheit von CHL1 während der Entwicklung die Apoptose von Körnerzellen aus der internen Körnerzellschicht des Kleinhirns, was folglich zum Verlust der Körnerzellen führt. Es wurde untersuchend belegt dass CHL1 und seine Bindungspartner einen definierten regulatorischen Effekt auf die verschiedenen Entwicklungsstadien von Kleinhirnneuronen und einen Einfluss auf die Zytoarchitektur der Großhirnrinde haben.
Kurzfassung auf Englisch: Cell adhesion molecules of the immunoglobulin superfamily are expressed in a wellcoordinated temporospatial pattern during nervous system development and are important for cerebellar histogenesis and formation of specific synaptic contacts. The close homologue of L1 (CHL1) is a member of the immunoglobulin superfamily and is abundantly expressed both in the developing and in the adult cerebellum. It is required for normal cerebellar cytoarchitecture and constitutive ablation of CHL1 in mice causes impaired cerebellar development. Stellate axons and Purkinje cell dendrites from CHL1-deficient mice show aberrant branching and reduced synapse formation which leads to progressive atrophy of axon terminals and loss of Purkinje cells during the first postnatal week. Moreover, granule cell migration seems to be impaired leading to the accumulation of this cells within the molecular layer of 7-day-old CHL1-deficient mice. Significant loss of Purkinje and granule cells has been reported in the adult CHL1-deficient mice suggesting that CHL1-ablation during development has consequences in the adult cerebellum. Therefore,
it is of great interest to identify CHL1 interaction partners and mechanisms involved in granule and Purkinje cell development.
In previous experiments the extracellular matrix molecule vitronectin was identified as novel binding partner of CHL1 using biochemical cross-linking, while the plasminogen activator inhibitor-2 (PAI-2) and patched, a receptor for hedgehog morphogens, were identified as novel binding partners of CHL1 using phage display. In this study binding of vitronectin, PAI-2 and patched to CHL1 was verified by co immunoprecipitation, ELISA and label-free binding assay. The co-localization of these proteins was confirmed in histological sections of postnatal cerebellum using immunohistochemistry and proximity ligation assay. Vitronectin and PAI-2 proved to bind to the extracellular part of CHL1 and induce neurite outgrowth and cell migration
in cultures of cerebellar neurons. A PAI-2-derived peptide, antibodies against vitronectin, PAI- 2, urokinase type plasminogen activator (uPA) and uPA receptor reduced granule cell migration. Interestingly, in 5-day-old mice interaction of vitronectin and CHL1 led to reduced proliferation and delayed differentiation of granule cell precursors, while their mutual interaction enhanced radial migration of granule cells two days later. Moreover, the trans-interaction of CHL1 with patched promoted neuritogenesis as well as neuronal migration and survival in cultures of cerebellar neurons. A sequence stretch in the extracellular CHL1 domain showing similarity to sonic hedgehog sequences mediated the binding of CHL1 to the first extracellular loop of patched. Patched- and CHL1-derived peptides, patched antibodies, the smoothened inhibitor SANT-1 and inhibitors of RhoA and Rho-associated kinase (ROCK) reduced CHL1- triggered neuritogenesis, migration and survival in cultures of dissociated cerebellar neurons. Inhibitors of smoothened, RhoA and ROCK prevented CHL1-triggered survival of cerebellar granule and Purkinje cells in organotypic cerebellar cultures. In histological sections from 10- and 14-day-old CHL1-deficient mice enhanced apoptosis of granule cells from the internal granule layer, but not of Purkinje cells, was observed, indicating that CHL1 regulates apoptosis of granule cells during the second postnatal week. In the present thesis novel binding partners of CHL1 and pathways that contribute to morphogenesis during postnatal cerebellar development were identified and characterized. Furthermore, I showed that CHL1 regulates proliferation and differentiation of granule cell precursors and that CHL1 induces neuritogenesis and migration of granule cells during the first postnatal week by binding to vitronectin, PAI-2 and patched. CHL1-ablation induces retarded migration of granule cells and their accumulation in the molecular layer. Additionally, CHL1 activates RhoA and RhoA-associated kinase via patched and smoothened-dependent signal transduction pathways. Triggering of these pathways contributes to the granule cell survival during the second postnatal week. CHL1-ablation induces apoptosis of granule cells from the internal granule layer during development, which consequentially leads to granule cell loss in the adult CHL1-deficient cerebellum. CHL1 and its novel interaction partners stongly
influence the development of the cerebellar cortex cytoarchitecture by regulating different developmental stages of cerebellar neurons within a well-defined time window.

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