FAQ
© 2016 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-81142
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8114/


Auswirkung der RAD51 Überexpression auf die Aktivität des Fanconi-Komplexes nach DNA-Schädigung

Role of RAD51 overexpession on activation of the Fanconi complex after DNA damage

Waldstein, Cora

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (1.936 KB) 


SWD-Schlagwörter: Homologe Rekombination , Bestrahlung
Freie Schlagwörter (Deutsch): DNA-Reparatur , WesternBlot , RAD51Überexpression
Basisklassifikation: 42.14
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Borgmann, Kerstin (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.09.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 02.11.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit war, den Einfluss der Überexpression von RAD51 – dem zentralen Protein der homologen Rekombination – auf die funktionelle Aktivierung der nachfolgenden Signalkaskade der DNA-Reparatur zu überprüfen. Dies wurde anhand der Phosphorylierung von ATM, ATR und FANCD2 nach Schadensinduktion mittels Bestrahlung beziehungsweise Behandlung mit Mitomycin C und Wasserstoffperoxid untersucht. In einer vorangegangenen Arbeit wurde bereits gezeigt, dass eine Überexpression von RAD51, nicht – wie erwartet – zu einer Resistenzbildung nach vergleichbarer Schadensinduktion führte (Parplys et al., 2015). Eine mögliche Ursache hierfür könnte die veränderte Synthese bzw. Aktivierung von Sensoren der DNA-Reparatur, wie z.B. ATM, ATR oder FANCD2, oder eine fehlerhafte Beladung des Chromatins mit RAD51 sein. In der vorgelegten Arbeit wurde der Einfluss der RAD51 Überexpression auf die Aktivierung der intrazellulären Signalkaskaden, vermittelt durch ATM und ATR, untersucht.

In den methodischen Vorarbeiten wurde zunächst der optimale Zeitpunkt für die maximale Aktivierung der Proteine ATM, ATR und FANCD2 nach Schadensinduktion untersucht. Für ATM wurde eine sehr frühe Aktivierung, nach 2-8h nach Bestrahlung, analog dazu für H2O2 ebenfalls nach 1-4h, und keine Aktivierung durch MMC beobachtet. Für die Aktivierung von ATR zeigte sich dagegen ein vollständig anderes Bild, mit einer schnellen und persistierenden Aktivierung von 0.5 bis 24h nach MMC, 24h für Bestrahlung und keine auffällige Aktivierung nach H2O2. Für FANCD2 zeigte sich im Wesentlichen nur eine Aktvierung durch Behandlung mit MMC. Basierend auf diesen Ergebnissen erfolgte in den weiteren Experimenten zum Einfluss der RAD51 Überexpression auf die Aktivierung der Signalkaskade die Extraktion bei Bestrahlung nach 8h, bei MMC nach 24 h und bei H2O2 nach 4h.

Bezogen auf die Aktivierung von ATM zeigte sich eine verminderte Aktivierung nach Bestrahlung unter RAD51 Überexpression und eine leicht erhöhte Aktivierung nach MMC und Wasserstoffperoxid. Bezüglich ATR war auffällig, dass die Expression von ATR selbst anstieg, die Aktivierung allerdings vergleichbar oder eher geringer im Vergleich zu den Kontrollzellen ausfiel. Die Aktivierung von FANCD2 war nach Behandlung mit H2O2 deutlich erhöht in Zellen mit RAD51 Überexpression. Diese beobachteten Unterschiede zeigten sich ebenfalls im zellulären Überleben nach Behandlung mit den verschiedenen Agenzien. So zeigte sich keine Veränderung in der zellulären Strahlenempfindlichkeit nach Bestrahlung bei Überexpression von RAD51, aber eine deutliche Sensitivierung nach Behandlung mit MMC und H2O2.

Die Arbeit zeigte damit erstmalig, dass die RAD51 Überexpression zu einer Störung der intrazellulären Signalkaskade auf der Ebene von ATR und FANCD2 führt, während die Aktivierung von ATM weitestgehend unverändert bleibt. Dies drückt sich auch auf der Ebene des zellulären Überlebens aus, mit einer Sensitivität gegenüber Agenzien, die insbesondere zur Schädigung in der S-Phase führen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die Überexpression von RAD51 insbesondere bei der Reparatur von Schäden, welche die aktive Replikation stören, auswirkt – entweder durch fehlerhafte Signalgebung, oder verminderte DNA Reparaturprozesse. Diese Beobachtungen sind insbesondere für Tumorentitäten von Bedeutung, für die bereits eine Überexpression von RAD51 beobachtet wurde. Möglich wäre, dass diese Tumore deutlich empfindlicher auf DNA-DNA vernetzende Agenzien, wie Cisplatin, sowie Topoisomerase I hemmende Agenzien wie Camptothecin, aber auch neue Inhibitoren wie PARP1 reagieren könnten und damit das Outcome dieser Patienten maßgeblich verbessert werden könnte.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this study was to investigate the effect of RAD51 overexpression on the activation of DNA-repair proteins. RAD51 is the central protein in the homologous recombination pathway of the DNA repair mechanism. The effect of RAD51 overexpression was analysed by investigating the phosphorylation of ATM, ATR and FANCD2 after irradiation, treatment with MMC and H2O2.
In a previous study, no influence of RAD51 overexpression on cellular resistance after comparable DNA damage was observed (Parplys et al., 2015). The reason could be a modified synthesis or activation of the sensors of DNA repair, for example ATM, ATR or FANCD2, or an inaccurate loading of RAD51 onto DNA. In our study, the influence of RAD 51 overexpression on the activation of intracellular pathways mediated by ATM and ATR was investigated.
In ancillary methodological studies, the time point of the maximum activation of the proteins ATM, ATR and FANCD2 after DNA damage was established. An early activation of ATM after irradiation (2-8h) and after treatment with H2O2 (1-4h), as well as no activation after treatment with MMC were detected. In contrast, the activation of ATR was fast and persistent after treatment with MMC (0,5-24h) and after irradiation (24h), and not detectable after treatment with H2O2. Only activation after treatment with MMC was observed for FANCD2, essentially. Based on these results, the protein extraction was performed 8h after irradiation, 24h after treatment with MMC and 4h after treatment with H2O2.
In RAD51 overexpression, we observed reduced activation of ATM after irradiation and slightly elevated activation of ATM after MMC and H2O2. With regard to ATR, an increased expression of the ATR protein was noticed, while its activation remained similar or slightly reduced in RAD51 overexpression compared to control cells. Furthermore, the activation of FANCD2 after exposure to H2O2 was substantially elevated in cells with RAD51 overexpression.
Similar findings were also observed in cellular survival after treatment with the various substances. In detail, no difference in cellular survival was noticed in RAD51 overexpression after irradiation, in contrast to a substantially reduced cellular survival after treatment with MMC and H2O2.
In conclusion, to the best of our knowledge, this work showed for the first time that RAD51 overexpression leads to dysfunction of the intracellular signalling cascade at the level of ATR and FANCD2, while the activation of ATM remains largely intact. This results in augmented sensitivity towards substances acting during the S-phase, which also impacts cellular survival. Our results indicate that RAD51 overexpression particularly impacts the repair of DNA damage disturbing active replication. This may be caused by dysfunctional signalling or disturbed response to DNA damage.
Our observations are of particular relevance for tumours with known overexpression of RAD51. Possibly such tumours would react much more sensitively towards DNA crosslinking agents such as Cisplatin, as well as towards topomerase-I-inhibitors (e.g., Camptothecin), and novel inhibitors such as PARP1. Thus, the outcomes of patients suffering from such neoplasms could potentially be improved significantly.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende