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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-81221
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8122/


Funktionalisierung von Nanocontainern für die biochemische und medizinische Anwendung

Functionalisation of nanocontainers for biochemical and medical applications

Kreuziger, Anna-Marlena

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Nanopartikel , Nanokapsel , Nanomedizin , Nanotechnologie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Krebsdiagonstik , Aptamere , Nanocontainer
Freie Schlagwörter (Englisch): nanocontainer , nanomedicin , nanotechnologie , aptamers , cancer
Basisklassifikation: 35.10 , 35.22 , 35.61 , 35.79
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Weller, Horst (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.09.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 31.10.2016
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurden verschiedene Möglichkeiten zur Funktionalisierung von Nanocontainern mit biologischen Affinitätsmolekülen untersucht und die erhaltenen Strukturen relevant in vivo und in vitro auf ihre spezifische Bindungsfähigkeit überprüft. Die erfolgreiche Verkapselung vom fluoreszierenden Nanopartikeln mit Diblockcopolymeren zum Nanocontainer (NC) ist dabei eine grundlegende Voraussetzung, um in biologischen Systemen arbeiten zu können. Die Funktionalisierung der Diblockcopolymere (DBC) über organische Synthesen sowie deren Charakterisierung mittels NMR und GPC werden im ersten Abschnitt umfangreich dargestellt. Als Beispiele sind Funktionalisierungen mit Glycosiden wie GalNAc über eine CDI-Aktivierung (Umsatz 25%) sowie α-d-Mannoheptulose(MH) über einen Linker mit der Click-Chemie (Umatz 20%) durchgeführt worden. Eine Vertiefung sowie Optimierung der Click-Chemie wurde im Hinblick auf die Funktionalisierung der NC mit größeren Affinitätsmolekülen wie DNA oder Proteinen untersucht. Die Umsätze der Click-Reaktionen konnten für die Kopplung von Glucose und Mannose an die DBC unter Verwendung von unterschiedlichen Click Katalysatoren in organischen sowie in wässrigen Medium auf 85-87% gesteigert werden. Zu den vielfältigen Möglichkeiten der Funktionalisierung gehört unter anderem die Kopplung von O6 -(4-Aminomethylbenzyl)guanin, welches zur weiteren bioorthogonalen Kopplung über ein sogenanntes SNAP-Protein in Zukunft eine erfolgsversprechende Anwendung für NC darstellt. Das zum Phosphoramidit aktivierte DBC (Umsatz 80%) wurde erfolgreich zur direkten Kopplung als Abbruchelement an der letzten Base in einer DNA Festphasensynthese genutzt. Das Produkt aus DNA und DBC konnte erfolgreich in der Gelelektrophorese sowie HPLC nachgewiesen werden. Der zweite umfangreiche Abschnitt befasst sich mit der bioorthogonalen Kopplung von biotinylierten NC, die mit NeutrAvidin versehen wurden. Diese konnten anschlieÿend erfolgreich mit biotinylierten DNA-Aptameren gekoppelt werden. Der erhalte NC mit Aptameren konnte in Dot Blots und Gelelektrophoresen auf die Qualität der Kopplung sowie zur Überprüfung von spezifischen als auch unspezifischen Wechselwirkungen systematisch untersucht werden. Im letzten Abschnitt wurden erste Nachweismethoden mit Nanocontainern in biologischen Systemen und biochemischen Verfahren gezeigt. Die ersten vielversprechenden SPR-Messungen mit MH, die an Nanocontainer gebunden sind, liefern Kd -Werte im nanomolaren Bereich und lassen den Schluss auf multivalente Bindungsereignisse zu. Zelluntersuchungen (in vitro) an HEPG2-Zellen wurden durchgeführt und lieferten neue Anhaltspunkte für die Optimierung der NC im medizinischen Forschungsbereich. In einer ersten in vivo Studie an Mäusen konnte die Fluoreszenz der funktionalisierten Nanocontainer mit E-Selektin spezifischen Aptameren in Gewebeschnitten des Tumors in geordneten Strukturen entang von Blutgefäßen nachgewiesen werden. Im Kontrolltier, das eine Lösung mit unfunktionalisierten Nanocontainern erhalten hat, konnte keine Fluoreszenz im Tumorgewebe beobachtet werden. Dieser Erfolg verdeutlicht das große Potenzial der Nanocontainer für die medizinische Forschung im Bereich der Krebsursachen sowie Früherkennungsdiagnostik.
Kurzfassung auf Englisch: In this work, different ways for the functionalization of nanocontainers with biological affinity molecules were investigated and the ability for specific binding of such structures has been tested by in vivo and in vitro studies. The profound knowledge of the encapsulation of fluorescent nanoparticles with diblock copolymers for the formation of a nanocontainer (NC) is necessary for their use in biological environments. Firstly, diblock copolymers (DBCs) were functionalized with different affinity molecules and characterized in depth via NMR and GPC. For example, glycosides like GalNAc and α-D-Mannoheptulose were coupled via CDI-activation (rate 25%) and with a linker via click chemistry (rate 20%), respectively. Further experiments and optimization of the click chemistry were carried out, which was then applied to the functionalization of NCs with bigger affinity molecules, such as DNA or proteins. The rates of the click reactions with DBCs were raised to 85-87% for glucose and mannose in organic and aqueous syntheses with different catalysts. The successful coupling of O6 -(4-Aminomethylbenzyl)- guanine (BG) is one of the various possibilities for the functionalization of DBCs. NCs functionalized with BG offer a promising approach for bioorthogonal coupling with the so-called SNAP protein in the future. DBCs were successfully activated to phosphoramidites with a rate of 80%. They were used as the terminal part, which was coupled directly to the last base in a DNA solid phase synthesis. The product of DNA and DBC was successfully detected in gel elec- trophoresis and HPLC. Secondly, a comprehensive section describes the bioorthogonal coupling of biotinlylated NCs. In a first step the NCs were covered with NeutrAvidin. In the following step, biotinylated DNA aptamers were bound to a vacant site of the NeutrAvidin. The synthesis of NCs with aptamers was controlled by dot blots and gel electrophoresis in order to confirm the quality of the coupling and to verify specific and unspecific interactions. In the third part of this work, NCs were tested in biological systems and in biochemical analysis. The first promising binding studies via SPR with α-D-Mannoheptulose func- tionalized NC provided Kd-values in a nanomolar range, which indicates multivalent bindings. Cellular in vitro studies on HEPG2-cells provided new information on the optimization of NCs for medical applications. In a first in vivo study on mice, fluorescence of NCs equipped with E-selectin specific aptamers was detected in tissue sections 90 of the tumor, along the blood vessels. In tumor tissue of the negative control mouse, which has been treated with a nonfunctionalized NC, no fluorescence was found. This success demonstrates the huge potential of nanocontainers in medical applications for early diagnosis in the therapy of cancer.

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