FAQ
© 2016 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-81475
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8147/


Neue Konzepte für nicht-ionische Inhibitoren der humanen Galactosyltransferase B sowie derhumanen Fucosyltransferase 5

Concepts for non-ionic inhibitors of the human galactosyltransferase B and the human fucosyltransferase 5

Niemeyer, Felix

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (9.862 KB) 


SWD-Schlagwörter: Inhibitor , Enzym , Blutgruppe , Magnetische Kernresonanz , Chemische Synthese , Design , Oberflächenplasmonresonanz , Metastase
Freie Schlagwörter (Deutsch): Sättigungstransferdifferenz NMR , NMR basierter Enzymassay , Strukturbasiertes Wirkstoffdesign, Ligandbasiertes Wirkstoffdesign
Freie Schlagwörter (Englisch): Structure based design , Ligand based design , saturation transfer difference NMR , NMR based enzyme assay , non-ionic donorsubstrate mimics
Basisklassifikation: 58.30
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.10.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 02.11.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Aufgrund der Relevanz glycosylierter Strukturen bei der Zellerkennung und Signaltransduktion gibt es großen Bedarf an Methoden zur Aufklärung der Funktion dieser Substanzklasse. Glycosyltransferasen (GTs) sind Enzyme beim Aufbau von Glycanen. Sie katalysieren die Übertragung einer Kohlenhydrateinheit von einem aktivierten Donor, häufig ein XDP Zucker, bei dem X eine heteroaromatische Nucleobase ist, die über Ribose und ein Diphosphat mit dem entsprechenden Zucker verknüpft ist. Während die Bindungsenergie hauptsächlich im Bereich der Nucleobase und des Diphosphates generiert wird, ist der Donorzucker für die Spezifität verantwortlich. In dieser Arbeit wurden daher Konzepte für den Ersatz beider Gruppierungen entwickelt.
Die humane Galactosyltransferase B (GTB) ist für eine Glycosyltransferase hervorragend charakterisiert und katalysiert den Transfer einer Galactoseeinheit von UDP-Gal auf das H-Antigen, wodurch das Blutgruppen B-Antigen gebildet wird. Dieses Enzym ist aufgrund der vielen verfügbaren Daten ein ideales Modellsystem für die Entwicklung von Inhibitoren. Um die Verfügbarkeit im Körper zu gewährleisten, muss das Diphosphat in UDP-Gal durch nichtionische Gruppen ersetzt werden, um zu wirksamen Inhibitoren zu gelangen. Auf dem Verständnis des Bindungsverhaltens aufbauend wurde ein neues Konzept entwickelt, um den Ersatz des Pyrophosphates durch ein hochpolares aber nichtionisches Sulfon zu ermöglichen. Die Synthese eines Galactosides, dass über ein Sulfon an ein Azid gebunden ist war erfolgreich. Da die Synthese des Sulfones im Aglycon größere Schwierigkeiten bereitet, wurden weitere Vereinfachungen der Moleküle untersucht. Donorsubstratanaloga, die Triazole anstelle der Nucleobase enthalten sind in-silico in der Lage Uridin als Nucleobase zu ersetzen. Die benötigten Alkin-Edukte konnten erfolgreich dargestellt werden und die Umsetzung zu Triazolen durch einfache Click-Chemie wurde anhand von Modellsystemen mit und ohne Galactose gezeigt.
Der Ersatz beider Phosphate im UDP-Gal ist unter energetischen Gesichtspunkten sehr erstrebenswert. Bissulfonamide als Ersatz beider Phosphate wurden daher insilico untersucht. Die entsprechenden Bausteine (ein geschütztes Galactosylamin und Sulfamoyluridin wurden erfolgreich dargestellt.
Auf der Suche nach hochaffinen und hochspezifischen Inhibitoren versprechen Bisubstratsanaloga den größten Erfolg. In dieser Arbeit wurde ein literaturbekanntes Molekül (ein Thiadiazolderivat) in docking Studien auf Seiten der Nucleobase verlängert. Die zugehörigen Bindungsaffinitäten wurden vorhergesagt. Während die Synthese und Affinitätsstudien von P. Leccese durchgeführt wurden, zeigte sich die Reihenfolge der Affinitäten als richtig und diese Moleküle zeigen herausragende Dissoziationskonstanten für nichtionische Glycosyltransferase-Inhibitoren von 9-17 uM.
Die humanen Fucosyltransferase 5 (Fut5) ist nicht so gut charakterisiert wie die GTB. Es ist bekannt, dass Lewis X Strukturen, die von der Fut5 aufgebaut werden, bei der Metastasierung von Krebs eine Rolle spielen. Daher sind Inhibitoren für dieses Enzym hochinteressant. Nichtsdestotrotz ist keine strukturelle Information für dieses Enzym verfügbar. Daher wurde ein Homologiemodell basierend auf der Struktur aus H. pylori entwickelt. Die niedrige Homologie ermöglicht allerdings kein strukturbasiertes design. Daher war es nötig das Enzym in ausreichenden Mengen für Affinitätsmessungen zu produzieren. Die Produktion in Insektenzellen war erfolgreich. Die nachfolgende kinetische Charakterisierung mittels NMR Progresskurvenanalyse (GDP-Fuc Km = 32 uM und kcat = 0.0055 s–1; N-Acetyl-D-lactosamin Km = 4 mM und kcat = 2.5 s–1) zeigte eine gute Übereinstimmung mit Literaturdaten.
Als Ausgangspunkt für ein ligandbasiertes Inhibitordesign wurde ein Pharmakophormodell der Nucleobase formuliert. Mit diesem Modell wurde ein Satz von 38 stark unterschiedlichen heteroaromatischen Verbindungen ausgewählt und mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) untersucht. Die zehn bestbindenden Strukturen wurden mittels STD-NMR (saturation transfer difference) auf ihre Kompetition mit dem natürlichen Donorsubstrat GDP-Fucose untersucht. Die zugehörigen Inhibitionskonstanten zeigen vielversprechende Kandidaten, die besten binden mit Dissoziationskonstanten von 0.12 mM. Unter diesen Molekülen zeigen zwei Azapurine nicht nur gute Affinitäten (KD von 1.3 mM bzw. 1.6 mM) sondern auch das Potenzial die Fragmente zu vergrößern. Hierfür wurde die Chemie der Azapurine untersucht und mehrere Derivate wurden mittels STD-NMR untersucht (KD von 0.24 mM bzw. 0.4 mM). Ebenso wurden drei Sulfonamide, die aus einem docking der GTB entstammen, mittels SPR untersucht (KD von 1.9 mM). Das beste Sulfonamid zeigt auch im STD Experiment Kompetition um die Bindungstasche. Die Affinitäten in diesen Experimenten und der vorgeschlagene Bindungsmodus zeigt Potenzial für die Verknüpfung dieser Fragmente.
Kurzfassung auf Englisch: Glycosyltransferases (GTs) play an important role in the biosynthesis of glycan structures. Glycosyltransferases (GTs) are the key enzymes in the biosynthesis of glycans, catalyzing the specific transfer of carbohydrate moieties from an activated donor to an acceptor substrate. Typical donors for glycosyltransferases are XDP sugars, where X is a nucleoside attached to a diphosphate (DP). Binding-energy and therefore affinity is mainly associated with the nucleobase as well as the diphosphate,while the donor sugar is important for specificity. To analyze the effect of glycosylation patterns in biological systems specific inhibitors of glycosyltransferases are of vital importance.
The human galactosyltransferase B (GTB) is (for a glycosyltransferase) extremely well characterized. GTB is responsible for the transfer of a galactose residue from UDP-Gal to the H-antigen thereby forming the blood group B-antigen. This enzyme is an ideal model for inhibitor design and inhibition studies. For bioavailability of a drug the diphosphate in UDPGal has to be replaced by a nonionic group. Still, high affinity ligands must mimic both the nucleobase and the pyrophosphate. Therefore, molecules that not only carry the galactose but also polar pyrophosphate-mimics in the aglycon are being sought.
Based on the knowledge of known binders, a concept to replace the phosphate by a highly polar yet non-ionic sulfone was developed. The synthesis of a galactoside linked via a sulfone to an azide was possible with and without protecting groups. To further simplify the synthesis of donor substrate analogues triazoles were analyzed regarding their potential as nucleobase substitutes. It could be shown that triazoles can indeed replace the nucleobase found in GTB. The alkine building blocks were successfully synthesized and the possibility to build the triazoles by simple click chemistry was tested with and without molecules containing galactose. Replacement of the second phosphate found in donor sugars is energetically favourable. Therefor the use of bissulfoneamides was evaluated in-silico and the corresponding building blocks (a protected galactosyl-amine and sulfamoyluridine) were successfully prepared. On the quest towards high affinity and high specificity inhibitors, bisubstrate analogues have proven to be most successful. In this work an existing molecule was used in a docking study for the elongation towards the nucleobase side. The binding affinities were predicted. The synthesis and affinity evaluation of the molecules was performed by P. Leccese and the order of affinities proved to be correct. These molecules show remarkable binding constants (9-17 uM) for non-ionic glycosyltransferase inhibitors.
The human fucosyltransferase 5 (Fut5) is not as well characterized as the GTB. It is well known that the Lewis X antigen produced by Fut5 is responsible for the metastasis of cancer cells. Therefore, it is important that inhibitors for this enzyme are developed. However, no structural information of this enzyme is currently known. The creation of a homology model based on the H. pylori structure allowed first insight into the mechanisms that govern binding of the donor substrate. The low homology did not allow structure-based drug-design. Therefore, the production of this enzyme for the measurement of affinities during a ligand-based design was mandatory. The expression in in insect cells was successful. The subsequent kinetic characterization via NMR progress curve analysis was in accordance with the literature data (GDP-Fuc Km = 32 uM and kcat = 0.0055 s–1; N-Acetyl-D-lactoseamine Km = 4 mM and kcat = 2.5 s–1).
As a starting point for the ligand-based design a pharmacophore of the nucleobase was proposed. With this model a set of 38 diverse heteroaromatic compounds was selected and screened by surface plasmon resonance (SPR). The data obtained was used to refine the pharmacophore and the 10 top-scoring compounds were evaluated by STD-NMR for competition with the natural donor substrate. The corresponding inhibition constants show promising candidates with the best dissociation constants being 0.12 mM. Among these molecules, two azapurines not only showed good affinity (KD of 1.3 mM and 1.6 mM) but also the potential for fragment growth. Therefore, the chemistry for the synthesis of azapurines was tested and several synthesized molecules were analyzed by STD-NMR (KD of 0.24 mM and 0.4 mM) together with the best sulfoneamide that emerged from another SPR screening of three substances (KD of 1.9 mM). The affinities found in all these experiments confirm that it is possible to grow the fragments towards a donor substrate analogue. The proposed binding mode has potential for further linking and growing attempts.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende