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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-81715
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8171/


Induction of functional human macrophages in humanized mice

Induktion von funktionellen menschlichen Makrophagen in humanisierten Mäusen

Engelhardt, Jan

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SWD-Schlagwörter: Makrophage
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pantel, Klaus (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 16.11.2016
Kurzfassung auf Englisch: Cancer still represents one of the most deadly diseases worldwide and efficient therapies to combat cancer are urgently required. The concept of cancer immunotherapy is based on the idea to redirect the body’s own immune system against cancer cells and using its potency to inhibit tumor growth, which has been demonstrated previously in several clinical trials. The need for evaluating human specific, immunological targets and mechanisms in preclinical settings pushed the development of advanced mouse models. In this context, human immune system (HIS) mice generated by transplantation of human hematopoietic stem cells into immunodeficient mice were described to mimic major parts of human hematopoiesis preferentially for B and T cell development. Although different HIS mice models have been established, a poor reconstitution of human innate immune cells still limits the use of HIS mice as preclinical model for cancer therapies. Incomplete development of innate human immune cells in HIS mice has been attributed to insufficient or lack of cytokine cross reactivity. Several reports have highlighted that the underrepresentation of human monocytes and macrophages in HIS mice is caused by a lack of cross reactivity of the mouse macrophage colony stimulating factor (CSF-1) to the human CSF-1 receptor (CSF-1R). Recently published affinity data however suggest, that mouse CSF-1 can indeed bind to human CSF-1R with ultra-low affinity. This indicates that physiological concentrations of mouse CSF-1 in conventional HIS mice are simply too low to promote human monocyte and macrophage development. To test this hypothesis, BALB/c-RAG (2)-/-Il2rg-/- mice (BRG mice) were injected with human hematopoietic stem cells and the developing human immune system was characterized. Primary and secondary lymphoid organs were found to be repopulated with high numbers of human lymphoid cells while human myeloid cell types were clearly underrepresented. Biacore binding assay confirmed that the binding affinity of mouse CSF-1 to human CSF-1R was 12,000-fold lower compared to its cognate receptor. In vitro characterization revealed that mouse CSF-1 exhibited biological activity on human CSF-1R at supraphysiological concentrations, which was demonstrated by activation of the CSF-1R signaling pathway and subsequent differentiation of human monocytes into macrophages. In HIS BRG mice, supraphysiological mouse CSF-1 levels were induced by antibody-mediated blockade of the mouse CSF-1R in vivo (HB2 mice). Blockade of CSF-1R did not only significantly decrease mouse monocytes and macrophages, but also resulted in increased frequencies of human monocytes in peripheral blood and de novo infiltration of human macrophages in all tissues analyzed. Human macrophages were inducible by anti-mouse CSF-1R antibody treatment at different time points after reconstitution independent of the initial overall reconstitution level. In a proof of concept experiment, enhanced human myelopoiesis was reversed by blocking mouse CSF-1 in vivo resulting in significantly reduced human blood monocytes and tissue macrophages. In addition, human macrophages were functional as shown by release of inflammatory cytokines upon stimulation with LPS in vivo. When human macrophages were induced in tumor bearing HIS BRG mice, tumor regression was observed in two independent xenograft models compared to mice virtually lacking human tumor-associated macrophages (TAMs). In depth analysis revealed that tumors of HB2 mice were infiltrated by both M1-like CD68+CD204- and M2-like CD68+CD204+ macrophages accompanied by a strong T cell infiltration. These results provide evidence for the key role of human macrophages in attracting and orchestrating anti-tumoral immune responses. Therefore, HB2 mice represent a novel mouse model to investigate human TAMs and the interaction with T lymphocytes in preclinical settings.
A limitation of the HB2 mouse model was the onset of graft versus host disease (GvHD) resulting in increased mortality rates. Histopathological characterization of affected HB2 animals identified granulomatous infiltrates composed of human macrophages and T cells in various tissues correlating with impaired tissue integrity, especially in the bone marrow. Strikingly, depletion of human macrophages by an hCSF-1R antibody, but not of human T cells, prevented the GvHD-like syndromes and mortality in HB2 mice.
Kurzfassung auf Englisch: Krebs stellt nach wie vor eine der tödlichsten Krankheiten weltweit dar und effiziente Therapien zur Krebsbekämpfung sind dringend erforderlich. Das Konzept der Krebsimmuntherapie, welches beinhaltet das körpereigene Immunsystem gegen Krebszellen zu mobilisieren, wurde bereits in mehreren klinischen Studien erfolgreich getestet. Signifikante Unterschiede zwischen dem menschlichen und dem murinem Immunsystem führten konsequenterweise zur Entwicklung neuer präklinischer Mausmodelle. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass humanisierte Mäuse (HIS Mäuse), hergestellt durch Transplantation von menschlichen hämatopoietischen Stammzellen in immundefiziente Mäuse, große Teile der menschlichen B und T Zellentwicklung reflektieren. Trotz dieser Tatsache ist die Verwendung der meisten humanisierten Mausmodellen aufgrund der Unterrepräsentation von Immunzellen des angeborenen menschlichen Immunsystems stark limitiert. Die unvollständige Entwicklung dieser angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und Granulozyten wurde bis heute auf eine unzureichende oder fehlende Kreuzreaktivität von bestimmten Mauszytokinen zurückgeführt. In diesem Kontext haben mehrere Veröffentlichungen gezeigt, dass für die niedrige Frequenz von menschlichen Monozyten und Makrophagen in HIS Mäusen eine fehlende Kreuzreaktivität des murinen Zytokins CSF-1 (Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor 1) zum menschlichen CSF-1-Rezeptor (CSF-1R) ursächlich ist. Kürzlich veröffentlichte Affinitätsdaten jedoch deuten darauf hin, dass murines CSF-1 in der Tat den menschlichen CSF-1R mit ultra-niedriger Affinität binden kann. Dies wiederum deutet darauf hin, dass die physiologische Konzentration von murinem CSF-1 in herkömmlichen HIS Mäuse lediglich zu gering ist um die Entwicklung von menschlichen Monozyten und Makrophagen in diesen Modellen zu fördern. Um diese Hypothese zu testen wurden in dieser Arbeit immundefiziente Balb/c-RAG (2)- / - IL2RG- / - Mäuse (BRG-Mäuse) mit humanen hämatopoetischen Stammzellen rekonstituiert und das entstandene menschlichen Immunsystem eingehend charakterisiert. Primäre und sekundäre lymphatischen Organe wie Milz und Lymphknoten beinhalteten eine sehr hohe Anzahl von menschlichen lymphatischen Zellen, wie B und T Zellen, während menschliche myeloide Zelltypen wie Makrophagen und Granulozyten deutlich unterrepräsentiert waren. Die etablierte humanisierte BRG Maus stellte somit ein geeignetes Modell dar um eine verbesserte Entwicklung menschlicher myeloider Zellen zu evaluieren. Zunächst wurden hierfür Biacore-Bindungstests durchgeführt, die bestätigten, dass die Bindungsaffinität von murinem CSF-1 auf den menschliche CSF-1R 12000-fach niedriger war als zum murinen Rezeptor. Weiterführende in vitro Experimente zeigten, dass murines CSF-1 bei erhöhten Konzentrationen eine biologische Aktivität auf dem menschlichen CSF-1R hat, die durch Aktivierung des CSF-1R-Signalwegs und anschließende Differenzierung von humanen Monozyten in Makrophagen nachgewiesen werden konnte. Um dieses Prinzip von in vitro zu in vivo zu übertragen, wurden in humanisierten BRG Mäusen stark erhöhte murine CSF-1 Level durch Antikörper vermittelte Blockade des murinen CSF-1R induziert. Dies führte nicht nur zu einer signifikanten Abnahme von murinen Monozyten und Makrophagen, sondern auch zu einer erhöhten Frequenz von humanen Monozyten im peripheren Blut und der Infiltration von humanen Makrophagen in allen untersuchten Organen. Bemerkenswerterweise konnten menschliche Makrophagen durch Gabe des anti-murine-CSF-1R-Antikörpers an verschiedenen Zeitpunkten nach der Rekonstitution und unabhängig vom ursprünglichen Humanisierungslevel induziert werden. Dass das stark erhöhte murine CSF-1 Level ausschlaggebend für den beobachteten Effekt der war, wurde anschließend durch eine Antiköper vermittelte Reduktion des murinen CSF-1 Levels nach Blockade des murinen CSF-1R bewiesen. In diesen Tieren wurde eine deutlich reduzierte Anzahl menschlicher Monozyten und Makrophagen festgestellt. Die Funktionalität der entstandenen Makrophagen wurde in vivo durch die Freisetzung inflammatorischer Zytokine als Antwort auf LPS Stimulation nachgewiesen. In zwei unabhängigen Xenograft Tumormodellen verursachte die gezielte Induktion von funktionellen menschlichen Makrophagen eine Regression des Tumorwachstums die mit der innertumoralen Präsenz von menschlichen Makrophagen und T Zellen korrelierte. Eine phänotypische Analyse der Tumor assoziierten menschlichen Immunzellen ergab, dass in anti-murin CSF-1R behandelten Tieren M1 ähnliche CD68+ CD204- also auch M2 ähnliche CD68+CD204 + Makrophagen als auch eine Vielzahl von menschlichen T detektiert werden konnten. In Tumoren von Kontrolltieren in denen keine Induktion erfolgte, wurden hingeben nur vereinzelt menschliche Immunzellen detektiert. Diese Ergebnisse liefern einen eindrucksvollen Beweis für die wichtige Rolle von humanen Makrophagen für die Entstehung einer antitumoralen Immunantwort auch in humanisierten Mäusen. Das etablierte Modell stellt somit ein neuartiges präklinisches Mausmodell dar das zur Untersuchung der Interaktion von menschlichen Tumor-assoziierten Makrophagen und T Zellen verwendet werden kann. Eine Limitation des generierten Modells war allerdings die Entwicklung einer Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) die zu einer erhöhten Mortalitätsrate der Mäuse mit humanen Makrophagen führte. Histopathologische Untersuchungen der betroffenen Tiere zeigten granulomatöse Infiltrate bestehend aus menschlichen Makrophagen und T Zellen in verschiedenen Geweben die mit einer beeinträchtigten Gewebeintegrität vor allem des Knochenmarks korrelierten. Interessanterweise verhinderte nur eine Depletion der menschlichen Makrophagen aber nicht die der menschlichen T Zellen die GvHD ähnlichen Symptome und somit auch eine erhöhte Mortalitätsrate.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein humanisiertes Mausmodell etabliert werden, das erstmalig die Induktion von funktionellen menschlichen Makrophagen erlaubt.

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