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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-81761
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8176/


Preparation and scoring of protein nano- and microcrystals for synchrotron and free-electron laser X-ray radiation sources

Herstellung und Identifizierung von Protein Nano- und Mikrokristallen für Synchrotron und Freie-Elektronen Laser Röntgenstrahlungsquellen

Schubert, Robin

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SWD-Schlagwörter: Proteine , Kristallographie , Synchrotron , Dynamische Lichtstreuung , Phasendiagramm
Freie Schlagwörter (Deutsch): Freie-Elektronen Laser , Nanokristalle , Mikrokristalle
Freie Schlagwörter (Englisch): Free-Electron laser , nano crystal , micro crystal
Basisklassifikation: 35.62
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.09.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 18.11.2016
Kurzfassung auf Englisch: Accompanying with the construction of high brilliant X-ray radiation sources like third generation synchrotrons and free-electron lasers (FELs) it became possible to use protein micro- and nanocrystals for protein structure determination. Therefore, the interest in nano- and microcrystals increased substantially and a strong demand arose in developing new methods for preparation and scoring of protein crystals with this size. In this study, several methods related to nano- and microcrystal production and scoring could be established or adapted, including protein buffer optimization, controlled induction of nucleation, non-invasive reliable nanocrystal detection in solution and potential applications of microcrystals for X-ray crystallography at synchrotrons.
It could be demonstrated that the protein buffer composition, which is a crucial parameter for maintaining protein stability, homogeneity and purity, can be optimized in a multi-condition approach with the use of Dynamic Light Scattering (DLS). Further, it was shown that DLS and Thermofluor provide complementary information and thus both methods should be combined in order to identify an ideal buffer composition that fulfils all criteria known to be beneficial for crystal formation.
Furthermore, DLS was used to obtain new information about the nucleation process of macromolecules. The growth kinetics of protein clusters were analyzed and revealed that the rate of mass-transport during cluster evolution is mainly diffusion-limited. The obtained results support the proposed theory of a two-step mechanism of nucleation and might demonstrate the first microscopic evidence of a transition from a cluster with high protein concentration to a crystal with higher structural order. Further, is was shown that DLS measurements can also be performed in micro-sized cavities of microfluidic devices and might circumvent the current limitation that the qualitative and quantitative evaluation of the crystallization process in microfluidic devices is solely based on visual inspection using a light microscope.
Beyond that, a novel and unique non-invasive and non-destructive method called Depolarized Dynamic Light Scattering (DDLS) could be established, which is capable of identifying nanocrystals in solution and allows following the nucleation and early stages of protein crystallization in real time. The obtained results provide clear evidence, that DDLS allows distinguishing between well-ordered crystalline particles and amorphous protein aggregates online during the crystallization process.
Additional emphasis was placed on developing new promissing applications of microcrystals for data collection at synchrotrons. A simple fixed target approach and data collection protocol was established that allows the rapid collection of complete diffraction data sets from less than 50 microcrystals at room-temperature. Due to the high temporal resolution of 40 milliseconds between each dataset, dynamic processes like site-specific or global radiation damage and potentially also chemical reactions, catalyzed by biological macromolecules, can be followed using this approach. Furthermore, it was shown that site-specific X-ray radiation damage can be used for phasing a multi-microcrystal diffraction dataset, when recording diffraction data at cryogenic temperature. This is particularly interesting, because it was not known if the non-isomorphism from multiple crystals would disguise the differences in structure factors upon induced radiation damage.
Accessorily, the structure of aminopeptidase P (APP) from the human malaria parasite Plasmodium falciparum was solved to high resolution using X-ray crystallography. The APP exhibits a three-domain architecture and was found as a homodimer in the crystal as well as in solution. The resulting structural APP model shows a high structural homology to human APP and Caenorhabditis elegans APP and in particular, the active site with a di-nuclear manganese cluster is highly conserved. The information indicates that P. falciparum and human APP share a common mode of substrate binding and a similar catalytic mechanism. The results contribute and support the development of antimalarial drugs.
Kurzfassung auf Deutsch: Einhergehend mit der Entwicklung von hoch brillanten Röntgenquellen wie Synchrotrons der dritten Generation und Freien-Elektronen Lasern (FELs) wurde es möglich, Nano- und Mikrokristalle zur Strukturaufklärung von Proteinen zu verwenden. Daher nahm das Interesse an Nano- und Mikrokristallen substantiell zu und es entstand ein großer Bedarf an der Entwicklung von neuen Methoden für deren Herstellung und Qualitätsabschätzung. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden mehrere Methoden entwickelt oder adaptiert, die sich mit der Nano- und Mikrokristallherstellung und -identifizierung beschäftigen. Dies umfasst Methoden zur Proteinpuffer-Optimierung, zur kontrollierten Induktion der Nukleation und zur nicht-invasiven verlässlichen Detektion von Nanokristallen in Lösung, sowie möglichen Anwendungen von Mikrokristallen für die Diffraktionsdatensammlung an Synchrotrons.
Es konnte gezeigt werden, dass die Proteinpufferzusammensetzung, die einen entscheidenden Parameter für den Erhalt der Proteinstabilität, -homogenität und -reinheit darstellt, in einem multifunktionalen Ansatz unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung (DLS) optimiert werden kann. Außerdem wurde gezeigt, dass mittel DLS und Thermofluor komplementäre Informationen erhalten werden. Daher sollten beide Methoden kombiniert werden, um eine Pufferzusammensetzung, die alle für die Kristallisation vorteilhaften Kriterien erfüllt, zu identifizieren.
Des Weiteren wurde DLS verwendet, um neue Informationen über den Nukleationsprozess von Makromolekülen zu gewinnen. Es wurde die Wachstumskinetik von Proteinclustern analysiert und die Ergebnisse zeigten, dass der Massenzuwachs während der Cluster-Evolution hauptsächlich diffusionslimitiert ist. Die erhaltenen Ergebnisse unterstützen zudem die Hypothese eines Zwei-Schritt-Mechanismus der Nukleation und stellen möglicherweise den ersten mikroskopischen Nachweis eines Übergangs von einem Cluster mit hoher Proteindichte zu einem Cluster mit hoher struktureller Ordnung dar. Zudem konnte gezeigt werden, dass DLS Messungen ebenfalls in den kleinen Kavitäten eines Mikrofluidikchips durchgeführt werden können. Die derzeitige Einschränkung von Mikrofluidik Anordnungen ist, dass die qualitative und quantitative Evaluation des Kristallisationsprozesses nur aufgrund einer visuellen Begutachtung mit Hilfe eines Lichtmikroskops durchgeführt werden kann. Durch den Einsatz von DLS kann diese Limitierung nun umgangen werden.
Darüber hinaus wurde eine einzigartige nicht-invasive und nicht-destruktive Methode basierend auf dem Prinzip der depolarisierten dynamischen Lichtstreuung (DDLS) etabliert. DDLS ermöglicht es, Nanokristalle in Lösung zu identifizieren und deren frühzeitiges Wachstum während der Kristallisation in Echtzeit zu verfolgen. Zudem zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass eine Unterscheidung zwischen kristallinen Partikeln mit hoher intrinsischer Ordnung und amorphen Aggregaten während des Kristallisationsprozesses mit Hilfe von DDLS möglich ist.
Ein weiterer Schwerpunkt wurde auf die Entwicklung von neuen vielversprechenden Anwendungen von Mikrokristallen zur Datensammlung an Synchrotrons gelegt. Es wurde ein Ansatz zur Probenmontage sowie eines Datensammelprotokolls etabliert, über den mit kurzem Zeitaufwand vollständige Datensätze von Mikrokristallen bei Raumtemperatur gesammelt werden können. Der Ansatz zeichnet sich dadurch aus, dass eine zeitliche Auflösung von 40 Millisekunden zwischen den einzelnen Datensätzen erreicht wird. Dies ermöglicht die Verfolgung von dynamischen Prozessen wie ortsspezifischem und globalem Strahlenschaden oder die Beobachtung von chemischer Reaktionen, die über Enzyme katalysiert werden. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass die Phaseninformation eines bei kryogenen Temperaturen aufgenommen Multi-Mikrokristall-Diffraktionsdatensatzes anhand von ortsspezifischem Strahlenschaden ermittelt werden kann. Dies ist im Besonderen interessant, da bislang unklar war, ob der Nicht-Isomorphismus zwischen den einzelnen Kristallen die durch den Strahlenschaden hervorgerufenen Unterschiede in den Strukturfaktoren überlagern würde.
Zusätzlich wurde die Röntgenstruktur der Aminopeptidase P (APP) des humanen Malariaerregers Plasmodium falciparum zu hoher Auflösung aufgeklärt. Es zeigte sich, dass APP aus drei Domänen aufgebaut ist und sowohl im Kristall als auch in Lösung als Dimer vorliegt. Das erhaltene Strukturmodell von APP weist eine hohe strukturelle Homologie zu humanem APP und zu APP von Caenorhabditis elegans auf. Besonders das aktive Zentrum, welches ein zweikernigen Mangan-Cluster enthält, ist hoch konserviert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass P. falciparum APP und humanes APP ein gemeinsames Muster der Substratbindung haben und ihr katalytischer Mechanismus ähnlich ist. Diese Informationen können dazu beitragen neue Wirkstoffe gegen Malaria zu entwickeln.

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