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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-82135
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8213/


Charakterisierung der in vivo-Selektion und Optimierung von auf Adeno-assoziierten Viren exprimierten randomisierten Peptidbibliotheken

Characterization of the in vivo selection and optimization of randomized peptide libraries expressed on adeno-associated viruses

Lampe, Melanie

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Adeno-assoziierte Viren , Peptidbibliotheken , Selektion , Next-Generation Sequencing , Gentherapie
Freie Schlagwörter (Englisch): Adeno-associated virus , Peptide libraries , Selection , Next-Generation Sequencing , Gene therapy
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Trepel, Martin (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.10.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 29.11.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Vor 50 Jahren wurde das Adeno-assoziierte Virus (AAV) entdeckt, seit über 30 Jahren wird an der Verwendung des Virus als Gentherapievektor geforscht und seit 13 Jahren werden modifizierte Kapsidvarianten des Vektors im Rahmen von AAV-Peptidbibliotheken hauptsächlich in vitro aber auch in vivo selektiert, um deren natürlichen Tropismus neu auszurichten. AAV-Peptidbibliotheken bestehen aus einer Vielzahl an Kapsid-modifizierten Vektoren, die sich durch die gezielte Insertion von im Virusgenom codierten und an der Kapsidoberfläche exprimierten randomisierten Peptiden voneinander unterscheiden. Trotz vieler Untersuchungen und Erkenntnisse rund um die Selektion dieser Bibliotheken, bei der sich für den jeweiligen Anwendungszweck bevorzugte Kapsidvarianten anreichern, gleicht besonders der Prozess der in vivo-Selektion und die Bestimmung der tatsächlichen Diversität der Peptidbibliotheken immer noch einer Art „Black-Box“. So war eine qualitative Auswertung der Peptidinserts lange Zeit nur über die Sanger-Sequenzierung zufällig ausgewählter Einzelklone möglich. Je nach Probenumfang können so zwar die häufigsten Sequenzen jeder Selektionsrunde identifiziert werden; eine sichere Abschätzung der Diversität und der Anreicherung der Sequenzen ist auf diese Weise, aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes, allerdings unrealistisch und die Wahrscheinlichkeit, einen potenziell gewebespezifischen Klon zu finden ist eher gering. Die Entwicklung des Next-Generation Sequencings (NGS) ermöglicht nun einen wesentlich tieferen Einblick in die Zusammensetzung nicht-selektierter wie auch selektierter Peptidbibliotheken und erlaubt Aussagen über die Diversität, Anreicherung und Spezifität einzelner Sequenzen oder Sequenzmotive zu machen. Des Weiteren kann die Qualität einer Peptidbibliothek bereits vor ihrer Selektion bestimmt und die Suche nach einem gewebespezifischen AAV-Klon wesentlich vereinfacht werden.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden AAV2-Peptidbibliotheken mit NNK-codierten (N = jedes der vier möglichen Nukleotide; K = Guanin oder Thymin) sieben Aminosäure langen Peptidinsertionen (NNK7-Peptidbibliothek) in den Zielgeweben Niere, Pankreas und Langerhans-Inseln, nach systemischer Injektion in Mäusen selektiert, mittels NGS analysiert und mit retrospektiv erhobenen NGS-Daten einer erfolgreichen in vivo-Selektion im Gehirn im Hinblick auf Diversität und Anreicherung verglichen. Hierbei wurde für die Selektion im Gehirn die stärkste Anreicherung bestimmt. Neben der Verifizierung des Sequenzmotives der Selektion im Gehirn („XDGXXWX“), welches bereits durch die Sanger-Sequenzierung von zehn Einzelklonen in Vorarbeiten gesehen wurde, wurden zwei weitere Sequenzmotive identifiziert. Während sich das Motiv aus der Selektion in der Niere („NXXRXXE/X“) als Gewebe-unspezifisch herausstellte, wurde bei den Selektionen in Pankreas und Langerhans-Inseln das gleiche Sequenzmotiv („XXDXTR/XX“) selektiert und stark angereichert. Zusätzlich konnte durch die Anwendung von Bewertungskriterien zur Berechnung von Anreicherung und Spezifität von Sequenzmotiven und einzelnen Sequenzen im Falle der Selektion im Pankreas ein das selektierte Motiv tragender Klon mit einer zum Zielorgan verschobenen Vektorverteilung erfolgreich identifiziert werden.
Im Zuge der Suche nach dem Ursprung des unspezifischen Sequenzmotivs „NXXRXXE/X“ wurden im zweiten Teil die Plasmidbibliothek sowie die unselektierte Virusbibliothek mittels NGS analysiert. Neben der erwarteten Anreicherung bestimmter Aminosäuren aufgrund des NNK-Codierungsschemas, wurde in der Plasmidbibliothek eine systematische Ungleichverteilung bestimmter Codons und in der Virusbibliothek eine verhältnismäßig starke Anreicherung des Motivs „NXXRXXX“ festgestellt.
Zum Zweck einer besseren initialen Gleichverteilung der Codons wurde im dritten Teil eine neue von unserer Arbeitsgruppe generierte AAV2-Trimer6-(-C)-Peptidbibliothek, mit Trimer-codierten und zur Erreichung einer höheren Abdeckung nur sechs Aminosäure langen Peptidinsertionen, auf Diversität untersucht und im Vergleich zur NNK-codierten Bibliothek in vitro selektiert. Trotz einer wesentlich verbesserten Gleichverteilung der Codons der Plasmidbibliothek, wurde in der Virusbibliothek das bekannte unspezifische, nur um eine Aminosäure verkürzte, Sequenzmotiv „NXXRXX“ angereichert. Bei diesem Motiv handelt es sich folglich um ein initial in der Virusbibliothek angereichertes Motiv, das einen strukturellen Vorteil für das AAV2-Kapsid bedeuten könnte. Schließlich zeigte der in vitro Vergleich der Trimer-basierten und der NNK-codierten Bibliothek zwar keinen generellen aber einen vom Selektionsziel abhängigen Vorteil einer der Bibliotheken. Damit konnte gezeigt werden, dass sich auch die neue AAV2-Peptidbibliothek zur Selektion von Tropismus-modifizierten Kapsidvarianten und zur Erweiterung des Zielspektrums von AAV2-Peptidbibliothek-Selektionen eignet.
Kurzfassung auf Englisch: Adeno-associated virus (AAV) was discovered 50 years ago, its applicability as gene therapy vector has been investigated for over 30 years and capsid-modified variants of this virus have been selected in the context of AAV display peptide libraries to redirect the viral tropism for 13 years. AAV display peptide libraries consist of a high number of capsid-modified vectors that differ in genome-coded insertions of randomized peptides within the viral capsid. Particles with desired properties can be isolated from such AAV display peptide libraries by screening them in subsequent selection rounds in vitro or in vivo. However, especially the selection process of in vivo screenings which is associated by a change of the library composition and a decreasing peptide diversity can still be considered a „black-box“. For a long time, sanger-sequencing of a limited number of randomly chosen library clones was the only possibility to analyze the enriched capsid variants. Depending on the sample number, this type of analysis enabled the identification of the most frequent peptide inserts of each selection round. A good estimation of peptide diversity and enrichment, however, is quite unrealistic with only few analyzed clones and the possibility to find a potential tissue-specific variant is low. The development of the Next-Generation Sequencing (NGS) provides deeper insights into the composition of primary and preselected peptide libraries and allows to estimate peptide diversity, as well as enrichment and specificity of single sequences or sequence motifs. Furthermore, the quality of a peptide library can be determined before using it for in vitro or in vivo screenings and the search for a tissue specific AAV clone can be simplified.
In the first part of this work, AAV2 display peptide libraries containing NNK-coded seven amino acid peptide insertions (N = each of the four possible nucleotides; K = guanine or thymine), were screened in the target tissues kidney, pancreas and islets of Langerhans after systemic injection into mice. After several selection rounds, the libraries were analyzed via NGS and compared with the retrospectively NGS-analyzed data of a successful in vivo screening in the brain, regarding diversity and enrichment. Furthermore, the existence of the brain-enriched sequence motif (“XDGXXWX”), which was seen already during Sanger sequencing of ten single clones previously, was verified and two additional sequence motifs were identified. The sequence motif selected in the kidney (“NXXRXXE/X”) turned out to be non-tissue-specific, while the second sequence motif (“XXDXTR/XX”) was highly enriched during the screening in pancreas and the islets of Langerhans. Furthermore, by applying assessment criteria to calculate the enrichment and specificity of sequence motifs and single sequences, a single pancreas-enriched clone could be identified.
In order to assess the origin of the non-specific sequence motif “NXXRXXE/X“, the plasmid library and the non-selected virus library were analyzed via NGS in the second part of this work. In addition to the expected enrichment of distinct amino acids due to the NNK coding scheme, a systematic unequal distribution of distinct codons in the plasmid library and a relatively strong enrichment of the motif “NXXRXXX“ in the virus library was identified.
To ensure a more equal distribution of amino acids within the peptide library’s inserts, our group generated a new AAV2 display peptide library with trimer-based nucleotide inserts. In order to enhance the coverage, the length of the peptide insert was reduced to six amino acids (i.e. six nucleotide trimers). In the third part of this study, this new library, named AAV2 Trimer6 (-C) display peptide library, was assessed regarding its diversity and selected in vitro in comparison to the NNK-coded library. Despite an improved equal distribution of the plasmid library´s codons, the non-specific sequence motif “NXXRXX“ was enriched in the virus library, being only one amino acid shorter than the non-specific motif observed in the NNK-library. Consequently, this motif seems to be initially enriched in the virus library, and seems to confer a structural advantage for the AAV2 capsid. Finally, the in vitro comparison of the trimer-based and the NNK-coded library showed that each library can be superior to the other one, depending on the target cells. Consequently, the selection of tropism-modified capsid variants from the new peptide library is feasible and furthermore, the target spectrum for the selection of AAV2 display peptide libraries can be extended with this library.

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