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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-82432
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8243/


S100A4 als Zielprotein der E3-Ligase Asb2β

S100A4 as a target of the E3-Ligase Asb2β

Braumann, Simon

pdf-Format:
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Basisklassifikation: 44.38
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Carrier, Lucie (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 19.12.2016
Kurzfassung auf Deutsch: Die hypertrophe Kardiomyopathie ist die häufigste monogenetische Herzerkrankung
und führt wegen des erhöhten Risikos für plötzlichen Herztod und bei Vorliegen einer
Ausflusstraktobstruktion oft schon in jungen Jahren zu massiven Einschränkungen des
alltäglichen Lebens. Obwohl bereits sehr viele zu HCM führende Mutationen bekannt
sind, ist die Pathogenese der Erkrankung noch immer nicht vollständig verstanden und
es fehlen kausale Behandlungsmöglichkeiten. Das Ubiquitin-Proteasom-System, das für
einen Großteil des intrazellulären Proteinabbaus verantwortlich ist, scheint eine
zentrale Rolle bei der Entstehung der HCM einzunehmen. Innerhalb des UPS
katalysieren E3-Ligasen die entscheidende Reaktion und stellen so sicher, welche
Proteine dem proteasomalen Abbau zugeführt werden. In einem Mybpc3-KI Mausmodell
der HCM wurde eine Herunterregulation der E3-Ligase Asb2β festgestellt, so dass Asb2β
und seine potenziellen Zielproteine in den Fokus unserer Arbeitsgruppe gelangt sind.
Zuvor konnten mit Filamin B und Desmin bereits zwei Strukturproteine des Sarkomers
bzw. des Cytoskeletts als Reaktionspartner von Asb2β identifiziert werden. Ziel dieser
Arbeit war die Validierung von S100A4 als neuem Interaktionspartner von Asb2β und
darüber hinaus die funktionelle Charakterisierung von S100A4 in künstlichem
Herzgewebe. Weiterhin wurde die Genexpression von Asb2β und S100A4 in
verschiedenen Grundlagenmodellen kardialer Erkrankungen untersucht. Die
wichtigsten gewonnen Ergebnisse waren:
1. Trotz der verstärkten Aktivität des UPS in neonatalen Mybpc3-KI HCM-Mäusen zeigte
sich in jungen und adulten Mybpc3-KI Mäusen eine niedrigere Asb2β-mRNAKonzentration
als in WT Tieren.
2. Im Lamin-Mausmodell mit dem Phänotyp einer dilatativen Kardiomyopathie und zwei
EHT-Modellen für pathologische Hypertrophie zeigten sich höhere S100A4-mRNAKonzentrationen
als in den Kontrollgruppen, während im Mybpc3-KI Mausmodell
niedrigere S100A4 mRNA-Konzentration festgestellt wurden.
3. Im Co-Transfektions-Assay zeigte sich, dass die S100A4 steady-state
Proteinkonzentration durch Co-Transfektion mit Asb2β WT niedriger als mit Asb2β Mut
war. Die Stabilisierung von S100A4 durch Zugabe des UPS-Inhibitors Epoxomicin
bewies, dass der Abbau von S100A4 im Proteasom stattfindet.
4. Eine starke Überexpression von S100A4 wirkte sich negativ auf Kraft, Kontraktionsund
Relaxationsgeschwindigkeit im Modell des künstlichen Herzgewebes aus.
Trotz vieler neuer Erkenntnisse bleibt abschließend festzustellen, dass für einen
sicheren Nachweis von S100A4 als Zielprotein von Asb2β weitere Versuche folgen
müssen. Sollten keine Antikörper-Bedingungen für endogenes S100A4 gefunden
werden, wäre eine Co-Immunopräzipitation mit und ohne UPS-Inhibierung nach Co-
Transfektion eine geeignete Alternative. Die Rolle von S100A4 in der komplexen
Pathogenese der hypertrophen Kardiomyopathie sollte bei der zukünftigen Erforschung
dieser Krankheit nicht außer Acht gelassen werden.
Kurzfassung auf Englisch: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most common monogenetic cardiac disease.
Together with left outflow tract obstruction its increased risk for sudden cardiac death
leads to a significant reduction in the qualitiy of life even in younger individiduals.
Although many mutations responsible for the developement of HCM have been
identified, its pathogenesis is yet to be understood completely and causal therapeutic
options are unavailable. The Ubiquitin-Proteasom-System degrades the major part of all
synthesized proteins and plays a pivotal role in the developement of HCM. Within the
UPS E3-Ligases catalyse the final reaction of the ubiquitination and thereby ensure
subtrate-specificty. An E3-Ligase called Asb2β has been found to be downregulated in
Mybpc3-KI mice, an animal model of HCM. Therefore potential targets of Asb2β have
gained our attention. Previously two sarcomeric proteins Filamin B and Desmin had
been identified as targets of Asb2β. Aim of this study was the validation of S100A4 as a
novel target of Asb2β followed by its functional effect on engineered heart tissue (EHT).
Moreover mRNA-levels of S100A4 and Asb2β were analysed in different models of
cardiac disease. In summary the results were:
1. Although the UPS in neonatal Mybpc3-KI mice is generally upregulated, Asb2β-mRNAlevels
were found to be decreased in young and adult Mybpc3-KI mice compared to wild
type controls.
2. In these mice S100A4-mRNA-levels were found to be decreased. Other cardiac
disease-models such as DCM-mice or pathologically hypertophied EHTs contained
higher S100A4-mRNA-levels.
3. Co-transfection of Cos-7-cells with S100A4 and a dysfunctional Asb2β mutant lead to
higher expression levels of S100A4 protein when compared to co-transfection with
Asb2β wild type. Adding of the UPS-inhibitor epoxomycin diminished (?) this effect and
lead to stabilization of S100A4, proving the degradation of S100A4 happened in the UPS.
4. Strong adeno-associated viral overexpression of S100A4 in EHT lead to significanlty
attenuated force developement as well as contraction and relaxation velocity.
Though this study yielded strong evidence for the Asb2β-mediated degradation of
S100A4 in the UPS, more experiments should follow for definite proof. Until a good
antibody signal for endogenous S100A4 is found, co-immunoprecipitation in cotransfected
samples with and without UPS-inhibition are likely to produce clarifying
results. S100A4 should not be overlooked when researching HCM in the future.

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