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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-72935
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/7293/


Proteolytische Aktivierung der GlcNAc-1-Phosphotransferase

Proteolytic activation of the GlcNAc-1-Phosphotransferase

Klünder, Sarah

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Mucolipidose Typ 2 , Lysosomale Funktion , Regulierte Intramembranproteolyse , Site-1-Protease , Site-2-Protease
Freie Schlagwörter (Englisch): Mucolipidosis type 2 , lysosomal function , regulated intramembrane proteolysis , Site-1 protease , Site-2 protease
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Braulke, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.02.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 09.10.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Die GlcNAc-1-Phosphotransferase ist ein Schlüsselenzym für die Biogenese von Lysosomen. Sie katalysiert die Generierung von Mannose-6-Phosphat-Resten an löslichen lysosomalen Enzymen, die Voraussetzung für deren Rezeptor-vermittelten Transport zu den Lysosomen ist. Der Golgi-residente GlcNAc-1-Phosphotransferase-Komplex ist aus drei verschiedenen Untereinheiten (alpha2beta2gamma2) aufgebaut, deren alpha- und beta-Untereinheiten als gemeinsames Typ-III-Transmembranprotein synthetisiert und im Lumen des cis-Golgi-Apparates durch die Site-1-Protease proteolytisch aktiviert werden. Sowohl der vererbbare Verlust der GlcNAc-1-Phosphotransferase-Aktivität, der mit der lysosomalen Speicherkrankheit Mucolipidose Typ II (MLII) assoziiert ist, als auch eine Defizienz der Site-1-Protease resultieren in Fehlsortierung lysosomaler Enzyme, verbunden mit lysosomalen Dysfunktionen und einer Akkumulation nicht abbaubarer Makromoleküle in den Lysosomen.
• Unter Verwendung von Site-1-Protease-defizienten Zellen und einem radioaktiven in-vitro-Aktivitätsassay konnte in dieser Arbeit erstmalig direkt gezeigt werden, dass die Proteolyse zwischen den Aminosäuren K928 und D929 des alpha/beta-Vorstufenproteins zu den reifen alpha- und beta-Untereinheiten essentiell für die Aktivität der GlcNAc-1-Phosphotransferase ist. Die alternative Spaltung einer MLII-assoziierten, mutierten Form des alpha/beta-Vorstufenproteins war enzymatisch inaktiv.
• Während die am besten charakterisierten Substrate der Site-1-Protease, SREBP1 und SREBP2, in Abhängigkeit vom Cholesterol-Gehalt der Zelle vom ER zum Golgi-Apparat transportiert und proteolytisch aktiviert werden, erfolgen der Transport und die proteolytische Aktivierung des alpha/beta-Vorstufenproteins der GlcNAc-1-Phosphotransferase Cholesterol-unabhängig. Inhibitorstudien, [35S]-Methionin-Pulse-Chase-Experimente und Immunfluoreszenzanalysen zeigten jedoch, dass der Transport zum Golgi-Apparat von der N-Glykosylierung, und die proteolytische Aktivierung des alpha/beta-Vorstufenproteins vom Calcium-Gehalt abhängen.
• Im Gegensatz zu anderen Substraten der Site-1-Protease erfolgt die Aktivierung der GlcNAc-1-Phosphotransferase unabhängig von der Site-2-Protease.  
Dennoch weisen Site-2-Protease-defiziente Zellen eine Fehlsortierung neu synthetisierter lysosomaler Enzyme, lysosomale Dysfunktionen und Akkumulation von nicht-abbaubarem Speichermaterial in den Lysosomen auf. Zusätzlich ist die Rezeptor-abhängige Endozytose verschiedener Liganden in Site-2-Protease-defizienten Zellen stark verringert. Die erzielten Ergebnisse lassen vermuten, dass bisher noch nicht identifizierte Substrate der Site-2-Protease essentiell sowohl für die Biogenese und Funktion von Lysosomen als auch für die Rezeptor-vermittelte Endozytose und den Transport von Liganden zu Lysosomen sind. Die hier vorgestellte detaillierte Beschreibung des morphologischen und biochemischen Phänotyps Site-2-Protease-defizienter Zellen trägt zum besseren Verständnis des fein regulierten Cholesterolhaushaltes und der zentralen Rolle von Lysosomen im Katabolismus von Makromolekülen, Autophagie und Endozytose/Phagozytose bei.

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