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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-79676
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/7967/


Characterisation of trafficking signals shared by different types of exported proteins in the human malaria parasite Plasmodium falciparum

Charakterisierung der Transportsignale, die verschiedenen Typen von exportierten Proteinen des humanen Malariaparasiten Plasmodium falciparum gemeinsam sind

Ullrich, Ann-Katrin

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SWD-Schlagwörter: Malaria , Plasmodium falciparum , Proteintransport
Freie Schlagwörter (Deutsch): Proteinexport , Transportsignale , PNEPs
Basisklassifikation: 42.13 , 42.36 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Spielmann, Tobias (Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.06.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 06.12.2017
Kurzfassung auf Englisch: Malaria is still one of the most devastating diseases worldwide. Vaccine development of the first promising candidate is currently ongoing but its efficacy has already been shown to fall short of commercially available vaccines applied against other diseases. Beside vaccine development, widespread resistances against different antimalarial drugs challenge the attempts to control this important disease.
The most severe form of malaria is caused by the protozoan parasite Plasmodium falciparum. During the erythrocytic stage the intracellular parasite exports a large number of proteins beyond its own parasite specific boundaries into the host red blood cell (RBC). This leads to host cell modifications that include the formation of Maurer’s clefts, membranous export structures in the host cell, and knobs, structures on the RBC surface. These structures are necessary for the survival and virulence of the parasite, as they enable the sequestration within the vasculature of the host. This avoids the clearance of the infected red blood cell (iRBC) by the spleen and this is believed to be a major reason for the malaria-associated pathology.
Two different types of proteins are exported – those that harbour a PEXEL motif (Plasmodium export element) and PEXEL negative exported proteins (PNEPs). PEXEL proteins are processed in the motif, an event essential for export. Thereafter, the new N-terminus containing a single conserved residue from the PEXEL motif takes over and guides further export. This region is comparable to the N-terminus of PNEPs, which also promotes export. The mature N-termini of PEXEL proteins and the N-termini of PNEPs are exchangeable and hence these two regions can be seen as a common core export domain of all exported proteins. However, due to (i) only a single conserved export promoting residue deriving from the PEXEL motif (here termed the ‘primary export signal’), (ii) the lack of a comparable residue in many PNEPs and (iii) a clear indication for additional trafficking regions further downstream (here termed the ‘secondary export signal’), the export promoting capacity and a possible consensus has so far remained elusive for this core export region.

In this thesis, sequences promoting export and sequences hampering export were assessed, both in naturally occurring N-termini of exported and non-exported proteins as well as in a neutral N-terminus that was specifically designed for this purpose. This neutral N-terminus enabled the investigation of the impact on export of specifically inserted amino acids and their particular position within the N-terminus. By means of this neutral N-terminus, proline (P) was found to be a strong blocking signal. It was further revealed that the primary positive signal is much more flexible than expected from the PEXEL consensus it derives from. Beside the typical PEXEL residues glutamic acid (E) and glutamine (Q) – the amino acids annotated as the most frequent as a primary positive signal – for instance threonine (T) and leucine (L) also promoted high levels of export. In contrast aspartic acid (D), which is annotated the third most frequently found amino acid at this position in the PEXEL motif, did not promote export at all. Hence, the consensus of the PEXEL motif may need to be revisited.
The secondary positive signal was found to range widely both in sequence and position. No concrete sequence was uncovered to promote export as a secondary positive signal from a natural protein. However, it was found that the residues acting as the primary export signal in the neutral N-terminus could also serve as a secondary export signal if multiples of these residues were used, albeit always promoting lower efficiency of export than as a primary signal. Furthermore, it was uncovered that contrary to some previous hypotheses, negative charge of the amino acids alone was not decisive for export. As amino acids with a high α-helix- or β-turn-forming propensity were overrepresented in N-termini of exported proteins, and such residues generally promoted better export, specific secondary structures may be beneficial for export. Finally it was found that larger, rather than smaller amino acids better promoted export. In conclusion this thesis provides data suggesting an increased plasticity of the primary export signal, uncovers the first sequence blocking export and informs on the amino acid residues that may contribute to the secondary positive export signal. The data however also indicate that the secondary export signal may be complex in nature and difficult to define in simple terms. Nevertheless, these results will form the basis for future attempts to predict the capacity of a region to act as the core export domain.
Kurzfassung auf Deutsch: Malaria ist immer noch eine der verheerendsten Krankheiten weltweit. Die Impfstoffentwicklung des ersten erfolgversprechenden Kandidaten läuft zurzeit, allerdings wurde bereits gezeigt, dass die Wirksamkeit des Impfstoffes, im Vergleich zu sonst kommerziell eingesetzten Vakzinen gegen andere Krankheiten, weit zurückbleibt. Neben der schlechten Impfstofflage hemmen weit verbreitete Resistenten des Erregers gegen die unterschiedlichen Antimalaria-Wirkstoffe die Kontrolle dieser bedeutenden Krankheit.
Die schwerste Form der Malaria wird durch den Protozoen Plasmodium falciparum hervorgerufen. Während der erythrozytären Phase exportiert der intrazelluläre Parasit eine erhebliche Anzahl an Proteinen über seine eigenen Parasiten-spezifischen Grenzen hinaus in die Wirtszelle, die rote Blutzelle. Die dadurch hervorgerufenen Modifikationen umfassen die Bildung von Maurer’s clefts, membranösen Exportstrukturen in der Wirtszelle, und Knobs, Strukturen an der Oberfläche der roten Blutzelle. Diese Strukturen sind erforderlich für das Überleben und die Virulenz des Parasiten, da sie die Sequestrierung der infizierten roten Blutzellen innerhalb der Blutgefäße des Wirtes ermöglichen und so die Beseitigung der infizierten Erythrozyten durch die Milz verhindern. Die Sequestrierung wiederum wird als wichtiger Grund für Malaria-assoziierte Pathologie angenommen.
Zwei unterschiedliche Typen von Proteinen werden exportiert – solche die ein PEXEL-Motiv (Plasmodium export element) aufweisen und PEXEL negative exported proteins (PNEPs). PEXEL-Proteine werden innerhalb des Motivs prozessiert, ein essentielles Ereignis für den Proteinexport. Anschließend übernimmt der neue N-terminus, welcher nur noch eine konservierte Aminosäure des PEXEL-Motivs enthält, den weiteren Export. Der N-terminus der prozessierten PEXEL-Proteine ist vergleichbar mit dem N-terminus von PNEPs, der ebenfalls Proteinexport vermittelt. Diese beiden Regionen sind austauschbar in ihrer Fähigkeit Export zu vermitteln, weshalb diese beiden Bereiche als eine gemeinsame Exportdomäne aller exportierten Proteine angesehen werden können. Bisher ist jedoch nur die konservierte Export-vermittelnde Aminosäure des PEXEL-Motivs in dem Bereich bekannt (welche von nun an als ‚primäres Exportsignal‘ bezeichnet wird). Solch eine vergleichbare Aminosäure fehlt bei vielen PNEPs. Außerdem gibt es deutliche Hinweise, dass sowohl der nach der Prozessierung entstandene PEXEL N-terminus wie auch die PNEP N-termini, Sequenz-abwärts weitere Exportsignale enthalten (von nun an als ‚sekundäre Exportsignale‘ bezeichnet). Aufgrund dieser Umstände war bisher sowohl die Export-vermittelnde Eigenschaft als auch ein möglicher Konsensus der gemeinsamen Exportdomäne schwer zu definieren.

In dieser Arbeit wurden Export-fördernde und -blockierende Sequenzen untersucht, sowohl von natürlich vorkommenden N-termini exportierter und nicht-exportierter Proteine, als auch in einem neutralen N-terminus, welcher eigens für diesen Zweck entwickelt wurde. Dieser neutrale N-terminus ermöglicht es, die Auswirkung eingefügter Aminosäuren (und deren spezifische Position) innerhalb des N-terminus auf den Export zu untersuchen. Mithilfe dieser neutralen Region konnte gezeigt werden, dass Prolin (P) ein starkes Export-blockierendes Signal ist. Ferner wurde deutlich, dass das primäre Exportsignal weitaus flexibler ist als durch den Konsensus des PEXEL-Motivs hätte angenommen werden können. Neben den klassischen PEXEL-Aminosäuren Glutaminsäure (E) und Glutamin (Q) – die Aminosäuren, die am häufigsten als primäre Exportsignale annotiert sind – rufen beispielsweise auch Threonin (T) und Leucin (L) hohe Exportlevels hervor. Asparaginsäure (D) hingegen, annotiert als die dritthäufigste Aminosäure an der entsprechenden Position innerhalb des PEXEL-Motivs, resultierte nicht in Export. Somit ist vermutlich eine neue Analyse des PEXEL-Konsensus‘ notwendig.
Das sekundäre Exportsignal war sehr divers, sowohl die Sequenz als auch die Position betreffend. Deswegen konnte keine Sequenz eines natürlichen Proteins ermittelt werden, die Export als ein sekundäres Exportsignal hervorruft. Allerdings konnte aufgedeckt werden, dass Aminosäuren, die als primäres Exportsignal fungieren können, ebenfalls als sekundäres Exportsignal wirken können, wenn mehrere dieser Aminosäuren eingesetzt werden. Die Exportrate war bei diesen Proteinen allerdings immer niedriger als beim Einsatz der jeweiligen Aminosäure als primäres Exportsignal. Ferner konnte gezeigt werden, dass – konträr zu einigen früheren Hypothesen – die negative Ladung einer Aminosäure nicht alleine ausschlaggebend für Proteinexport ist. Da Aminosäuren mit hohen α-helix- oder β-turn formenden Eigenschaften in N-termini exportierter Proteine überrepräsentiert sind (und solche Aminosäuren meist bessere Exportraten hervorgerufen haben), sind bestimmte Sekundärstrukturen eventuell förderlich für Proteinexport. Des Weiteren schienen größere, eher als kleinere, Aminosäuren besseren Export zu vermitteln. Zusammenfassend stellt diese Thesis Daten bereit, die die Plastizität des primären Exportsignals deutlich erweitern. Außerdem deckt sie die erste Export-blockierende Sequenz auf und zeigt die Aminosäuren auf, die eventuell innerhalb des sekundären Exportsignals mitwirken, wobei dieses Signal in natürlichen Proteinen sehr komplex und schwer definierbar zu sein scheint. Dennoch bilden diese Daten die Voraussetzung für zukünftige Vorhersagen der Exportkapazität der gemeinsamen Exportdomäne.

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