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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-83967
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8396/


Characterization of regulatory T cells and Th17 cells as reservoir of HIV-1 in chronic infection

Charakterisierung regulatorischer T-Zellen und Th17 Zellen als Reservoir für das HI-Virus 1 in chronischer Infektion

Dunay, Gábor Artúr

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SWD-Schlagwörter: HIV, Gedächtinzelle , Regulatorischer T-Lymphozyt , Polymerase-Kettenreaktion
Freie Schlagwörter (Deutsch): Th17 Lymphozyt , Interleukin-17, Nanolitertropf-Digitale-Polymerase-Kettenreaktion , Viruskultur
Freie Schlagwörter (Englisch): HIV , T memory cells , Regulatory T lymphocytes , PCR , Th17 lymphocytes , Interleukin-17, Droplet Digital PCR , Viral Outgrowth Assay
Basisklassifikation: 44.75
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hauber, Joachim (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.01.2017
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 27.02.2017
Kurzfassung auf Englisch: This work has been carried out in order to assess the possible role of CD4+ T cell subpopulations Th17 and Treg, as reservoirs of HIV in patients on long-term cART. Furthermore, the potential use of Droplet Digital PCR was demonstrated in quantifying proviral DNA using relatively small amounts of blood samples in these patients with very low viral loads. In parallel, the replication competent HIV reservoir was assessed in these clinical samples by use of a quantitative viral outgrowth assay (qVOA).
At the same time, frequencies of Th17 and Treg cells in peripheral blood were investigated in a cohort of HIV patients. In agreement with earlier findings, the absolute counts of Th17 were shown here to be decreased in viremic HIV patients, while their numbers were restored to near healthy levels by long-term antiretroviral therapy.
To determine the frequencies of Th17 cells, a surface marker based identification of this subset was performed in parallel with a direct identification of IL-17 producing cells after in vitro stimulation with phytohaemagglutinin and ionomcycin (intracellular cytokine staining, ICS). In particular, it could be demonstrated that the identification of these cells based solely on published surface markers considerably overestimates the number of IL-17 producing CD4+ T cells.
To determine the size of the reservoir in Th17 cells, IL-17 expressing cells of HIV patients have been isolated based on surface expression of this cytokine. However, the amount of cells obtained using this method in peripheral blood samples was insufficient to quantify the HIV reservoir by ddPCR and qVOA.
The CD4+ Treg subpopulation was analyzed in the context of viremic and treated HIV infection, and previous findings could be confirmed, showing that Treg frequencies are relatively increased in the case of low CD4+ T cell counts and in viremic patients.
A study of the HIV reservoir in Treg has been presented, in a cohort of 10 chronically HIV infected patients on cART. No differences between proviral DNA loads and replication competent viral reservoir between Treg, central and effector memory (Tcm and Tem) cells could be demonstrated. Thus, this study presented evidence that may require the re-evaluation of the role of Treg as a privileged cellular reservoir of HIV, demonstrating that their proviral HIV burden is similar to that of memory subsets.
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von Th17 und regulatorischen T Zellen (Treg) als mögliches Reservoir des HI-Virus (HIV) bei langjährig antiviral behandelten HIV Patienten zu erfassen. Darüber hinaus wurde die Eignung der Droplet Digital PCR Technologie, eine neue Methode für die Quantifizierung proviraler DNA Sequenzen bei diesen Patienten mit sehr niedriger Viruslast und wenig Ausgangsmaterial demonstriert. Parallel wurde das replikationskompetente HIV Reservoir in diesen klinischen Blutproben mittels quantitative viral outgrowth assay (qVOA) erfasst.
Zeitgleich wurden die Frequenzen von CD4+ Th17 Zellen und CD4+ Treg Zellen in einer ausgewählten HIV Kohorte analysiert. Übereinstimmend mit der Literatur konnte gezeigt werden, dass die absolute Anzahl der Th17 Zellen im peripheren Blut in der unbehandelten HIV Infektion sinkt. In langzeitbehandelten Patienten konnte jedoch eine langsame Restoration der absoluten Anzahl von Th17 Zellen beobachtet werden.
Zur Erfassung der Frequenz der Th17 Zellen wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei etablierte Methoden eingesetzt. Einerseits wurden die Zellen durch eine Reihe von Oberflächenmarkern identifiziert, anderseits wurde diese Subpopulation parallel auch direkt anhand der in vitro IL-17 Produktion nach Stimulation mit Phytohaemagglutinin und Ionomycin im Intrazellulären Zytokin Assay (ICS) untersucht. Durch den Vergleich der beiden Methoden konnte demonstriert werden, dass der Nachweis von Th17 Zellen ausschließlich mit Hilfe von Oberflächenmarkern die Zahl der tatsächlich IL-17-produzierenden Zellen stark überinterpretiert.
Zur Erfassung des HIV Reservoirs in Th17 Zellen wurden IL-17 produzierende Zellen spezifisch anhand ihrer IL-17 Produktion isoliert. Allerdings konnte aus peripheren Blutproben nicht genügend Material zur Ausführung weitergehender Experimente zur Quantifizierung des Reservoirs (qVOA, ddPCR) gewonnen werden.
Die Analyse der Treg Zellen in der Kohorte ergab eine Zunahme der relativen Frequenz der Treg Zellen in den CD4+ T Zellen von Patienten mit nachweisbarer Viruslast und einer geringen Anzahl an CD4+ T Zellen.
Zur Beantwortung der Frage, ob regulatorische Zellen ein HIV Reservoir darstellen, wurden Treg Zellen aus klinischem Material von zehn HIV infizierten Patienten isoliert. Der Gehalt proviraler HIV DNA wurde mittels ddPCR bestimmt und der Anteil replikationskompetenter Viren mittels qVOA untersucht. Es konnten keine signifikanten Unterschiede an proviralen DNA Mengen oder replikationskompetenten Viren zwischen verschiedenen CD4+ Subpopulationen Treg, Zentrale und Effektor-Gedächtniszellen (Tcm und Tem) nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen geben zudem Hinweis darauf, dass die Rolle der Treg Zellen als bevorzugtes Reservoir für das HI-Virus im Vergleich zu anderen CD4+ Gedächtniszellen nicht eindeutig belegbar ist.

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