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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-84055
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8405/


Design, Synthese und Analyse von Inhibitoren des Hämagglutinins der aviären Influenza H5N1

Design, Synthesis and Analysis of Inhibitors of Hemagglutinin of Avian Influenza H5N1

Winkel, Karsten Marco Dieter

pdf-Format:
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Basisklassifikation: 35.33 , 35.52 , 35.51 , 35.25 , 35.63
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.07.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 01.03.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Die Influenza ist eine hochansteckende, durch Viren ausgelöste Krankheit. Bei saisonalen Ausbrüchen sterben bis zu 500 000 Menschen pro Jahr.2 Bei besonders verheerenden pandemischen Ausbrüchen, wie der „Spanischen Grippe“ von 1918 stiegen die Zahlen der Todesopfer auf 20 – 50 Millionen. Auch wenn die Herkunft des Erregers bisher nicht eindeutig geklärt werden konnte, zeigte sich zumindest bei den späteren Pandemien von 1957 und 1968, dass es sich bei den Erregern um Viren handelte, welche sich durch genetische Reassortierung aus aviären Influenzaviren entwickelt hatten.117-120 Seit 1997 treten wiederholt Fälle von Übertragung eines Vogelgrippevirus auf den Menschen auf. Der Erreger des Subtyps A/(H5N1) in seiner hochpathogenen Form weist hierbei eine extrem hohe Sterblichkeitsrate von über 50 % auf. Das Ausbleiben einer Pandemie ist vor allem der bisher nicht auftretenden Übertragung von Mensch zu Mensch zuzuschreiben.
Der Primärkontakt eines Influenzavirus zu einer Zelle wird über das virale Hämagglutinin hergestellt. Es ist somit das target für den Entwurf eines entry-Inhibitors. Das homotrimere Lectin bindet an Sialinsäure-terminierte Strukturen der Glycocalyx. Im Rahmen dieser Arbeit wurden basierend auf einer Röntgenkristallstruktur eines Hämagglutinins H5 im Cokristall mit einem Rezeptoranalogon verschiedene Inhibitorkonzepte entwickelt. Zum einem wurden Liganden entworfen, die sich im Kern der Struktur der N-Acetylneuraminsäure bedienten und durch Modifikationen die Affinität deutlich steigerten. Zum anderen wurde aufbauend auf einem virtuellem screening ein Fragment-basiertes de novo Design durchgeführt.
Beim virtuellen screening wurden drei Substanzbibliotheken mit insgesamt mehr als 1400 Strukturen getestet. Aus dem Ergebnissatz konnte eine sehr gute strukturelle Basis für den weiteren Designprozess gewonnen werden. Zusätzlich konnte die Kenntnis sich wiederholender Anordnungen funktioneller Gruppen, bzw. ihrer elektrostatischen Potentiale, genutzt werden, um in nur wenigen Schritten aus der Basisstruktur den sehr vielversprechenden Liganden 8 zu entwickeln. Dieser verfügte über eine theoretische freie Bindungsenergie von -65.4 kcal/mol. Für die Darstellung des Moleküls konnte des Weiteren erfolgreich eine Synthesestrategie etabliert werden. Von Bindungsstudien wurde aufgrund zu geringer Löslichkeit in wässrigen Puffersystemen abgesehen.
Für die Sialinsäure-basierten Liganden wurden zunächst Untersuchungen zu C-9 Aminokonjugaten der N-Acetylneuraminsäure als strukturelle Alternativen getätigt. Diese waren von großem Interesse, da die Derivatisierung der Seitenkette nach Trunkierung aufgrund der auftretenden Nebenprodukte synthetisch problembehaftet war. Die in silico Studien zeigten, dass die Bindungsaffinitäten der C-9 Aminokonjugate und der analogen Aminokonjugate trunkierter N-Acetylneuraminsäure sehr ähnlich waren. Es gelang drei der entworfenen Liganden erfolgreich darzustellen und zu isolieren. Mittels SPR-Spektroskopie wurden die Dissoziationskonstanten des Ethylaminoderivats KD, 15 = 86.4 μM, des n-Propylaminoderivats KD, 16 = 195 μM und des iso-Propylaminoderivats KD, 17 = 221 μM bestimmt. Diese waren damit in guter Übereinstimmung mit den virtuellen Bindungsstudien. Da die etablierte Syntheseroute nur zu einem eingeschränkten Produktspektrum einen einfachen Zugang bot, wurde von einer Kombination dieses Ligandenkonzepts mit dem funktionalisiertem Aglycon abgesehen, obwohl die Affinitäten bewahrt wurden.
Für die ursprünglichen Liganden mit funktionalisiertem Aglycon konnte eine Syntheseroute etabliert werden. Im Verlauf derer wurden vor allem Herausforderungen bezüglich der Isolation der Produkte überwunden. Es gelang drei verschiedene Liganden darzustellen, von denen zwei zusätzlich zu dem funktionalisierten Aglycon eine Modifikation der Glycerolseitenkette besaßen. Für beide Liganden wurden Moleküldynamiksimulationen durchgeführt, anhand derer das unterschiedliche Wirken der einzelnen Segmente der Liganden beschrieben und die Bindungsprozesse besser verstanden werden konnten. Für den Liganden ohne Seitenkettenmodifikation 42 und den Cyclopropylmethylamino-modifizierten Liganden 48 konnten mittels SPR-Spektroskopie die Bindungsstärken bestimmt werden. Starke unspezifische Wechselwirkungen beeinflussten jedoch die Messungen. So wurden bei der thermodynamischen Auswertung der Daten die Dissoziationskonstanten zu KD, 42 = 6.2 mM und KD, 48 = 677 μM bestimmt. Die kinetische Auswertung hingegen ergab KD, 42 = 126 μM und KD, 48 = 6.38 μM. Als alternatives Verfahren wurden zusätzlich kompetitive STD-NMR-Titrationen durchgeführt. Aus den erhaltenen Daten wurden durch Anwendung des one site competition Modells die inhibitorischen Kostanten berechnet. Es wurden Werte von bis zu KI, 42 = 2.7 μM, KI, 48 = 253 nM und für den 4-Aminobuttersäure-modifizierten Liganden bis zu KI, 49 = 177 μM erhalten. Die Verbindungen 48 und 49 gehören somit zu den potentesten bisher beschriebenen monovalenten Liganden des Hämagglutinins H5.
Kurzfassung auf Englisch: Influenza is a highly infectious disease caused by a viral pathogen. Every year up to 500 000 humans die during seasonal outbreaks. The most devastating influenza pandemic was the "Spanish flu" in 1918. It resulted in 20 - 50 million deaths worldwide. Although the origin of the pathogen is still unproven today, it is known that the viruses leading to pandemics in 1957 and 1968 had evolved from avian influenza viruses through genetic reassortment. Since 1997 there have been hundreds of reported cases of humans contracting an infection of this zoonosis. The viruses are of the subtype A/(H5N1) in their highly pathogenic form. The mortality rate in these cases was exceptionally high, exceeding 50 %. The absence of pandemic outbreaks amongst humans is mainly due to the very improbable human-to-human-transmission. Up to now there has not been a verified case but adaptation to human hosts remains a threat.
The infection cycle starts with the influenza virus establishing a primary contact via its hemagglutinin, making it the target for entry inhibitors. The homotrimeric lectin binds to terminal sialic acid moieties of the glycocalyx. In the experimental part of the study, inhibitor structures were developed utilizing an X-ray crystal structure of hemagglutinin H5 co-crystallized with a receptor analog. Two different underlying concepts were applied in the design process. One approach was an entirely artificial ligand whose de novo design was based on a virtual screening of fragment libraries. The other concept made use of the known natural ligand. The N-acetylneuraminic acid moiety was modified, thus increasing its theoretical affinity significantly.
Virtual screening was carried out using three libraries containing more than 1400 structures. The docking results yielded one very promising structure as a strong basis for further design cycles. Careful analysis of the top scoring structures revealed repeating patterns in the positioning of functional groups or rather their electrostatic potentials. Based on these findings the highly promising ligand 8 was created in only a few iterations. The theoretical free binding energy was calculated to be -65.4 kcal/mol. Furthermore, a strategy for total synthesis was established. The resulting substance was not soluble in common water-based buffers, therefore no binding studies were conducted.
With respect to sialic acid-based ligands, studies on C-9 amino conjugates as structural alternatives to amino conjugates of truncated N-acetylneuraminic acid were undertaken. These were of high interest because truncation and derivatization led to a variety of by-products hampering work up and reducing yields. In silico studies showed similar binding affinities for both classes of ligands. Three newly designed structures were successfully synthesized and isolated. Dissociation constants for all three were determined using SPR-spectroscopy: The ethylamino derivative KD, 15 = 86.4 μM, the n-propylamino derivative KD, 16 = 195 μM and the iso-propylamino derivative KD, 17 = 221 μM. These results were in good agreement with the virtual binding studies. Due to a limited synthesizeable product spectrum, this ligand concept was not combined with the functionalized aglycone although affinities were retained.
Synthesis of in silico designed ligands with functionalized aglycone was successfully accomplished. While establishing the synthetic route, isolation of pure products proved to be difficult. Preventing the formation of certain by-products and optimizing work up protocols overcame these obstacles. Three ligands were synthesized, two of which were modified at the glycerol side chain in addition to the functionalized aglycone. For a better understanding of the binding processes, molecular dynamics simulations were carried out for the latter ligands. These gave a valuable insight into the collaboration of the various segments of each molecule. SPR-spectroscopy binding studies were used for the ligand with unmodified side chain 42 and the cyclopropylmethylamino-derivative 48. Owing to the strong interference of unspecific interactions the interpretation of the results was difficult. Thermodynamic data analysis yielded dissociation constants KD, 42 = 6.2 mM and KD, 48 = 677 μM, whereas kinetic analysis resulted in KD, 42 = 126 μM and KD, 48 = 6.38 μM. Respectively, as a complementary method competitive STD-NMR-titration was employed. The resulting data were consistent and matched the one site competition model well. Therefore, STD-NMR results were considered to be more reliable. The measured inhibitory constants were down to KI, 42 = 2.7 μM, KI, 48 = 253 nM and for the 4-aminobutyric acid modified ligand down to KI, 49 = 177 nM. Consequently, the compounds 48 and 49 are among the strongest known monovalent ligands of hemagglutinin H5 reported up to the present date.

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