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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-84385
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8438/


Das Fragile X Syndrom: Untersuchung des zellulären Interaktionsmusters der physiologischen und einer pathogenen FMRP-Variante

The Fragile X Syndrome: A comparison of the cellular interaction pattern of physiological FMRP and a pathogenic variant

Egbers, Anna

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Fragiles X Syndrom , FMR1 , FMRP , FMRP-I304N
Freie Schlagwörter (Englisch): Fragile X Syndrome , FMR1 , FMRP , FMRP-I304N
Basisklassifikation: 44.48 , 44.33 , 42.13 , 42.15
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kindler, Stefan (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.02.2017
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 27.03.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Das Fragile X Syndrom ist eine der häufigsten Ursachen für genetisch bedingte intellektuelle Beeinträchtigung. Es handelt sich um eine Trinukleotidexpansionserkrankung, die in einem Ausfall des betroffenen Gens FMR1 resultiert. Das Genprodukt FMRP wird in den betroffenen Individuen nicht gebildet. Es zeigt sich interindividuell ein sehr variabler Symptomenkomplex mit somatischen Auffälligkeiten, kognitiven Beeinträchtigungen und Verhaltensauffälligkeiten. Auch bei einer einzelnen Punktmutation im FMR1-Gen, die zu einem Aminosäureaustauch an Position 304 des Proteins (FMRP-I304N) führt, zeigt sich das klinische Bild des Fragilen X Syndroms. Das Protein FMRP wird in diesem Fall exprimiert, allerdings in veränderter Form. Es wird vermutet, dass FMRP in den subzellulären Transport, die Stabilität und die Translation von neuronalen mRNAs involviert ist. Inwiefern der Ausfall von FMRP zur Symptomatik des Fragilen X Syndroms führt, ist Ziel zahlreicher Forschungsarbeiten und konnte bisher nicht abschließend geklärt werden. Auch fehlen bisher erfolgreiche therapeutische Optionen. Um ein besseres Verständnis bezüglich der molekularen Wirkweise von FMRP zu erhalten, wurde in der vorliegenden Arbeit nach Interaktionspartnern von FMRP und seiner veränderten Proteinvariante FMRP-I304N gesucht. Hierfür wurden Fusionsproteine in HEK 293-Zellen generiert, die mittels Affinitätschromatographie isoliert wurden. Im Western Blot konnte ihr Interaktionsmuster, sowie die Art der Bindung mit FMRP verifiziert werden. Die Proteine PRKDC, NONO, ILF3 (110kDa-Isoform), DDX1, EF1alpha und RPS6 konnten als Interaktionspartner identifiziert werden. Keines der untersuchten Proteine zeigt gegenüber der Proteinvariante FMRP-I304N ein verändertes Bindungsmuster. Die Untersuchungen liefern somit keinen Hinweis auf den molekularen Pathomechanismus der Erkrankung. Die Analyse der bisher bekannten Funktionen der Interaktionspartner unterstützt die Vermutung einer wichtigen Funktion von FMRP im RNA-Metabolismus von Neuronen. Zusätzlich konnte die Möglichkeit einer Regulation der Transkription über PRKDC und ILF3 formuliert werden. Zur Detektion des genauen subzellulären Interaktionsortes zwischen FMRP und seinen Interaktionspartnern erfolgte die immunzytochemische Färbung von embryonalen Hippokampusneuronen der Ratte. Es zeigten sich Co-Lokalisationen im Zytoplasma des Zellkörpers, in den Dendriten und im Zellkern. Es ist also von einer ubiquitären Funktion von FMRP in allen neuronalen Zellkompartimenten auszugehen.
Kurzfassung auf Englisch: The Fragile X Syndrome is one of the most common inherited forms of intellectual disability. It is caused by a trinucleotide repeat expansion and results in the functional loss of the FMR1 gene. Thus, the gene product FMRP is not synthesized. Affected individuals present with a variable range of symptoms, including different somatic abnormalities, cognitive impairment and behavioural disorder. Interestingly, a single point mutation in the FMR1 gene that leads to an amino acid change in position 304 of the protein (FMRP-I304N) also causes Fragile X Syndrome, indicating that the modified gene product is functionally impaired. It is assumed that FMRP plays a role in the subcellular transport, stability and translation of neuronal mRNAs. However, it is still unclear why the functional loss of FMRP results in the specific symptoms of Fragile X Syndrome. Furthermore, effective treatment for patients suffering from the Fragile X Syndrome is not yet available. This study identifies protein interaction partners of FMRP to better understand its molecular function. Therefore, FMRP and FMRP- I304N fusion proteins were generated in HEK 293 cells and isolated by affinity chromatography. Individual protein interaction patterns and binding modes were analysed via Western blotting. The proteins PRKDC, NONO, ILF3 (110kDa- isoform), DDX1, EF1alpha and RPS6 were identified as FMRP associated proteins, which also efficiently bind to FMRP-I304N, thus not providing a hint regarding the molecular pathomechanism of the illness. Reported functions of the identified interaction partners suggest that FMRP plays an important role in RNA metabolism in neurons. Embryonic hippocampal rat neurons were utilized to determine the subcellular distribution of putative interaction partners via immunocytochemistry. For individual proteins, a co-localisation with FMRP was shown in the cytoplasm of the cell body, in dendrites and in nucleus, respectively. Therefore, it can be assumed that FMRP is involved in distinct steps of RNA metabolism proceeding in different cell compartments, such as transcription/pre- mRNA processing (nucleus) and mRNA translation and stability (cytosol), respectively.


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