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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-84556
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8455/


Structural Characterization of Small basic protein (Sbp) and Accumulation associated protein (Aap) : two Proteins involved in Biofilm Formation in Staphylococcus epidermidis

Strukturelle Charakterisierung von Small basic Protein (Sbp) und Accumulation associated Protein (Aap) : zwei Proteine beteiligt an Biofilmbildung durch Staphylococcus epidermidis

Fayyaz, Madiha

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SWD-Schlagwörter: Biofilm , Chromatographie , Kristall , Röntgen-Kleinwinkelstreuung , Oligomerisation
Freie Schlagwörter (Deutsch): Medizinische Implantate , Dynamische Lichtstreuung , CD-Spektrometrie , Ab initio Modelling , Protein-Kristallographie
Freie Schlagwörter (Englisch): Medical implants , Dynamic light scattering , CD spectrometry , Ab initio modelling , Protein crystallography
Basisklassifikation: 42.13 , 42.30 , 42.12
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.03.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 10.04.2017
Kurzfassung auf Englisch: Staphylococcus epidermidis is a nosocomial pathogen, which infects biotic and abiotic surfaces by forming adherent biofilms. Biofilm is a multilayered microbial community formed by the production of an extracellular matrix. The constituents of extracellular matrix, consisting of proteins, polysaccharides and lipids, regulate different stages of biofilm formation. Once a biofilm is matured, the infection becomes chronic especially in case of implanted medical devices (IMDs). Among many other components of extracellular matrix, small basic protein (Sbp) and accumulation associated protein (Aap) play key roles in biofilm formation in S. epidermidis. Aap consists of two domains A and B. Domain B is reported to be involved in biofilm formation and consists of glycine rich repeats called G5 domains. The genes encoding for Sbp and three G5 domain constructs of Aap domain B (G51E, G51EG52 and G51EG52EG53) were successfully cloned and expressed in E. coli. The concentration dependent non-specific oligomerization/aggregation of purified Sbp was studied in solution, using SAXS after improving the solubility and stability of protein. A low-resolution structure ab initio model of Sbp monomer has been proposed to present its ellipsoidal shape using bead modeling approach by applying the interpretation of SAXS measurements. X-ray diffraction of G51EG52EG53 crystals, obtained by sitting drop vapour diffusion method, revealed some initial leads, including unit cell parameters, symmetry and number of molecules per asymmetric unit to solve the structure in future. The low resolution elongated rod-like ab initio models of three G5 constructs have been generated. The SAXS data showed a regular increase in Rg and Dmax, while going from small to large G5 construct with stepwise addition of G5.E units. Based on native MS, MST and SEC data, it was further suggested that there is no interaction observed between Sbp and G5 constructs under particular in vitro experimental conditions. This work contributes towards the better understanding of organization of proteins in the extracellular matrix produced during biofilm formation in S. epidermidis.
Kurzfassung auf Deutsch: Staphylococcus epidermidis ist ein nosokomiales Pathogen, das biotische und abiotische Oberflächen durch die Bildung adhärenter Biofilme infiziert. Biofilm ist eine mehrschichtige, mikrobielle Gemeinschaft, die durch eine zum Teil selbsterzeugte extrazelluläre Matrix zusammengehalten wird. Die Bestandteile dieser extrazellulären Matrix sind Proteine, Polysaccharide und Lipide, deren Synthese Einfluss in verschiedenen Stadien der Biofilmbildung reguliert ist. Sobald ein Biofilm gereift ist, verläuft eine solche Biofilm-assoziierte Infektion insbesondere bei implantierten medizinischen Geräten chronisch. Als eine unter vielen anderen Komponenten der extrazellulären Matrix spielen das kleine basische Protein(Sbp) und das Akkumulation assoziierte Protein (Aap) eine wesentliche Rolle bei der S. epidermidis Biofilmbildung insbesondere bei icaADBC-negativen Stämmen.. AAP besteht aus zwei Domänen A und B. Die Bedeutung der Domäne B an der Biofilmbildung konnte bereits hinreichend gezeigt werden. Die Domäne B besteht aus Glycin-reichen Wiederholungen, die G5-Domänen genannt werden. Die Gene, die für Sbp und drei G5-Domänenkonstrukte von Aap-Domäne B (G51E, G51EG52 und G51EG52EG53) codieren, wurden erfolgreich kloniert und in E. coli rekombinant exprimiert. Die konzentrationsabhängige unspezifische Oligomerisierung / Aggregation von gereinigtem Sbp wurde in Lösung untersucht, wobei SAXS nach Verbesserung der Löslichkeit und Stabilität der Proteine verwendet wurde. Ein ab-initio-Modell des Sbp-Monomers mit niedriger Auflösung wurde erarbeitet, um seine ellipsoide Form unter Verwendung des Wulstmodellierungsansatzes in dem die Interpretation von SAXS-Messungen angewendet wird, darzustellen. Aus der Röntgenbeugung von G51EG52EG53 Kristallen, die durch das Tropfen-Dampf-Diffusionsverfahren entstanden sind, konnten erste Strukturdaten, einschließlich der Elementarzellenparameter, der Symmetrie und der Anzahl der Moleküle pro asymmetrischer Einheit gewonnen werden, um die Struktur in Zukunft lösen zu können. Mithilfe nativer MS- und SEC-Daten konnte keine Interaktion von Sbp- und G5-Konstrukten unter den verwendeten in vitro-experimentellen Bedingungen nachgewiesen werden. Die langgestreckten, stabförmigen Ab-initio-Modelle mit niedriger Auflösung von drei G5-Konstrukten wurden erzeugt. Diese Arbeit trägt zum besseren Verständnis der Organisation von Proteinen in der extrazellulären Matrix bei, die während der Biofilmbildung in S. Epidermidis produziert wird.

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