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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-85321
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8532/


Genetische und biochemische Analyse des Aktivators der Hsp90-ATPase-Aktivität (Aha1) aus Leishmania donovani (Ross, 1903)

Bartsch, Katharina

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SWD-Schlagwörter: Leishmania donovani , Hitzeschock
Freie Schlagwörter (Deutsch): Hitzeschockprotein 90 , Co-Chaperonen , Aha1
Basisklassifikation: 42.36 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Clos, Joachim (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 31.05.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Die Leishmaniose ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit, die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zu den wichtigsten vernachlässigten, tropischen Krankheiten gezählt wird. Verursacht wird sie durch die humanpathogenen protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania (L.). Die obligat intrazellulären Parasiten werden durch den Biss einer infizierten weiblichen Sandmücke auf den Menschen übertragen. Beim Wirtswechsel vom poikilothermen Insektenvektor auf den homoiothermen Säugetierwirt erfahren die Parasiten drastische Veränderungen der Umgebung. Die rasche Erhöhung der Umgebungstemperatur und der saure pH-Wert im Phagosom infizierter Makrophagen induzieren die Stadiendifferenzierung der Parasiten von extrazellulären Promastigoten in der Mücke zu pathogenen Amastigoten im Wirt.
Bislang ist unbekannt, welche molekularen Mechanismen der Stadienumwandlung zugrunde liegen. Bekannt ist, dass eine Hitzeschock-Antwort in Leishmanien ausgelöst wird, bei der vermehrt Hitzeschockproteine (Hsps) synthetisiert werden. Zudem führt eine pharmakologische Inhibition des Hitzeschockproteins 90 (Hsp90) durch die spezifischen Inhibitoren Radicicol (RAD) oder Geldanamycin (GA) ebenfalls zu einer Stadienumwandlung von Leishmanien. Hsp90 spielt somit eine wichtige Rolle in der Stadiendifferenzierung und ist sowohl für das Promastigoten- als auch das Amastigotenstadium von Leishmanien essentiell.
Hsp90 ist ein hoch konserviertes und konstitutiv exprimiertes Chaperon, das in allen untersuchten Eukaryoten vorkommt. Als molekulares Chaperon weist es wichtige Funktionen in der Zelle auf und dient u. a. der Reifung und Aktivierung einer Vielzahl von Klientenproteinen. Hsp90 wird dabei von einer Reihe von Co-Faktoren unterstützt. Diese regulieren und stabilisieren den Hsp90 Chaperonen-Zyklus. Zu diesen gehören Chaperonen und Co-Chaperonen wie Hsp70, Stip1, Sgt, P23 und Aha1. Zusammen bilden diese Proteine den Hsp90 Multi-Chaperonen-Komplex.
In Leishmania spp. ist Hsp90 ein zytosolisch lokalisiertes Protein, das von mehreren, identischen Genkopien in der Zelle codiert wird. Im Chaperonen-Zyklus erfährt Hsp90 ATP-induzierte Konformationsänderungen, die durch Co-Chaperonen reguliert werden. Eines dieser Co-Chaperonen ist Aha1, der stärkste bekannte Aktivator der Hsp90-ATPase-Aktivität. Strukturelle Analysen zu Aha1 wurden bereits veröffentlicht, jedoch ist wenig über die Bedeutung von Aha1 in Leishmania spp. bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte daher die Charakterisierung von Aha1 in L. donovani, dem Verursacher der tödlichen, viszeralen Form der Leishmaniose. Für Expressions-Analysen und Lokalisationsstudien wurden zunächst spezifische polyklonale Antiseren hergestellt. Die Analysen ergaben, dass Aha1 über den Lebenszyklus von L. donovani hinweg konstitutiv exprimiert wird. Ko-Präzipitationen mit Hsp90 bestätigen eine Interaktion von Aha1 und Hsp90. Zudem wurden in der vorliegenden Arbeit mittels homologer Rekombination Aha1 Gen-Austauschmutanten in L. donovani erzeugt. Dies stellt die erste Deletion von Aha1 in einem protozoischen Parasiten dar. Die lebensfähigen Nullmutanten wiesen keine auffälligen morphologischen Veränderungen im Vergleich zum Wildtyp auf. Auch in in vitro Wachstumsversuchen zeigten sich keine Auswirkungen der Deletion von Aha1. Somit ist Aha1 kein essentielles Protein im Promastigotenstadium von L. donovani. Dennoch wurde eine Sensitivität der Nullmutanten gegenüber Ethanol-Stress beobachtet, was Hinweise darauf gibt, dass Aha1 eine Rolle in der Proteinfaltung spielt. Interessant war, dass die Hsp90-Inhibitoren RAD und GA gegensätzliche Wirkungen auf die Aha1-abhängige Proliferation haben. Parasiten, die Aha1 überexprimieren sind hypersensitiv gegen RAD-Behandlung, während Aha1-Nullmutanten sensitiv gegen GA sind. Diese Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Bindungsmechanismen von RAD und GA hin. Aha1 spielt außerdem eine wichtige Rolle für das intrazelluläre Überleben des pathogenen Amastigotenstadiums von L. donovani. Zudem wird Aha1 über Exosomen in die Wirtszelle von L. donovani sekretiert, was Hinweise darauf gibt, dass Aha1 immun-modulatorische Effekte in Makrophagen hat.
Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse dienen dem Verständnis eines weiteren am Hsp90 Multi-Chaperonen-Komplex beteiligten Co-Chaperons in L. donovani. Diese liefern die Grundlage für zukünftige Untersuchungen von Aha1, insbesondere im Hinblick auf die Interaktion mit Hsp90 sowie Hsp90-unabhängige Funktionen.
Kurzfassung auf Englisch: Leishmaniasis is distributed worldwide and classified as an important neglected tropical disease by the World Health Organisation (WHO). It is caused by human-pathogenic protozoan parasites of the genus Leishmania (L.). The obligate intracellular parasites are transmitted via the bite of female infected sandflies to mammalian hosts. During the transmission from a poikilothermic insect vector to a homeothermic mammalian host, parasites encounter radical changes. The rapid increase in temperature and the acidic milieu in the phagosomes of infected macrophages induce the stage differentiation from extracellular promastigotes in the sandfly to pathogenic amastigotes in the host.
It is still unknown which molecular mechanisms exactly regulate this stage conversion. It is however known that a heat shock response is induced in Leishmania with an increased synthesis of several heat shock proteins (Hsps). Moreover, a pharmacological inhibition of heat shock protein 90 (Hsp90) by the specific inhibitors radicicol (RAD) or geldanamycin (GA) also induces a stage conversion. Therefore Hsp90 plays a key role during stage differentiation of Leishmania and is essential both for the promastigote and amastigote stages.
Hsp90 is a highly conserved and constitutively expressed chaperone in all studied eukaryotes. As a molecular chaperone Hsp90 has important functions in the cell and is involved in the maturation and activation of a multitude of client proteins, many of them key regulators. In doing so, Hsp90 is supported by several co-factors. These regulate and stabilise the Hsp90 chaperone cycle. The co-factors include chaperones and co-chaperones, e.g. Hsp70, Stip1, Sgt, P23 and Aha1. Together, they assemble the Hsp90 multi-chaperone complex.
In Leishmania spp. Hsp90 is a cytosolic protein encoded by a high gene copy number. During the chaperone cycle Hsp90 experiences ATP-induced conformational changes that are regulated by co-chaperones. One of these co-chaperones is Aha1, the strongest known activator of the Hsp90 ATPase activity. Structural analyses were published but little is known about Aha1 functions and role in Leishmania spp.. In this work a characterisation of Aha1 in L. donovani, the causative agent of the most severe form of leishmaniasis, was performed. Firstly, specific polyclonal antisera were produced for expression and localisation studies. Analyses showed Aha1 to be constitutively expressed during an in vitro stage conversion of L. donovani. Co-precipitation with Hsp90 and the cytosolic localisation of Aha1 confirmed an interaction of Aha1 and Hsp90. Secondly, Aha1 gene replacement mutants were generated in L. donovani using homologous recombination. This represents the first deletion of Aha1 in a protozoan parasite. The viable null mutants exhibited no morphological changes compared with wild type parasites, and in vitro growth experiments also showed no effects for the deletion of Aha1. Therefore, Aha1 is not essential in L. donovani promastigotes. However, a sensitivity of null mutants to ethanol stress could be observed, suggesting an Aha1 function in protein folding. Interestingly, the Hsp90 inhibitors RAD and GA have opposing effects on Aha1-dependent proliferation. Parasites over-expressing Aha1 are hypersensitive to RAD treatment while Aha1 null mutants are sensitive to GA. The results suggest different binding mechanisms of RAD and GA. Moreover Aha1 has an important role in the intracellular survival of the pathogenic amastigote stage of L. donovani. Aha1 is also secreted via exosomes into the host cells, suggesting an immune-modulatory effect of Aha1 in macrophages.
The results obtained in this study add to the understanding of another Hsp90 co-chaperone’s function in L. donovani. This opens the way for further studies of Aha1, especially regarding the interaction with Hsp90 and its Hsp90-independent functions.

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